О  ПРОЯВЛЕНИИ  МЕЖВИТАМИННЫХ  ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ  РЕТИНОЛА  И  АЛЬФА-ТОКОФЕРОЛА  В  ТКАНЕВОМ  ДЫХАНИИ  ПЕЧЕНИ  КУР

Костюк  Инна  Александровна

канд.  с.-х.  наук,  и.  о.  доцента  кафедры  нормальной  и  патологической  физиологии  Харьковской  государственной  зооветеринарной  академии,  Украина,  Харьковcкая  обл.,пгт  Малая  Даниловка

Е-mail: 

В  связи  с  известными  межвитаминными  взаимодействиями  ретинола  и  альфа-токоферола,  а  также  дополнительным  применением  в  питании  людей  и  в  рационах  животных  [1;  3;  8;  9]  целесообразно  изучение  их  общего  влияния  на  энергетический  аппарат  клетки.  В  работе  изучались  межвитаминные  взаимодействия  мембранотропных  веществ  ретинола  (витамин  А)  и  альфа-токоферола  (витамин  Е)  в  процессах  тканевого  дыхания  в  печени  кур.

Цель  работы  —  определить  особенности  процессов  тканевого  дыхания  и  окислительного  фосфорилирования  в  митохондриях  печени  при  совместном  применении  в  рационе  повышенных  доз  витаминов  А  и  Е.

В  рацион  кур  породы  Род-Айленд  в  возрасте  180  дней  вводили  дополнительно  витамины  А  и  Е  в  виде  масляных  препаратов,  в  повышенных  дозах  и  различных  сочетаниях  (табл.  1).  В  рацион  кур  контрольной  группы  вводили  добавки  в  рекомендуемых  дозах  [4;  6].  После  40  дней  применения  добавок  витаминов  А  и  Е,  во  время  наибольшего  их  накопления  в  яичном  желтке  и  печени,  определяли  показатели  дыхательной  активности  митохондрий  печени:  скорости  дыхания  в  разных  метаболических  состояниях  митохондрий  (V₂,  V₃,  V₄,  V_днф),  коэффициент  дыхательного  контроля  (ДК),  интенсивность  и  эффективность  фосфорилирования  (ИФ  и  АДФ/О).  После  закладки  яиц  для  инкубации  и  получения  цыплят  от  экспериментального  поголовья,  определяли  такие  же  показатели  у  цыплят  суточного  возраста.

Методы  исследования:  выделение  митохондрий  из  клеток  печени  методом  дифференциального  центрифугирования  и  регистрация  поглощения  кислорода  митохондриями  в  инкубационной  среде  полярографическим  методом  [5,  с.  92],  определение  витаминов  А  и  Е  с  применением  фотоколориметрических  и  хроматографических  методов  [5].

Результаты.

Эффекты  витаминов  А  и  Е  в  процессах  тканевого  дыхания  имели  отличия  у  птицы  разного  возраста.  Негативное  влияние  накопления  витаминов  А  и  Е  в  печени  на  энергетические  процессы  в  митохондриях  было  выявлено  в  нашем  опыте  только  у  суточных  цыплят  и  у  кур  в  возрасте  330  дней.  А  вот  у  кур  возрастом  220  дней,  которые  потребляли  эти  витамины  в  высоких  дозах  на  протяжении  40  дней,  установлена  стимуляция  окисления  субстратов  митохондриями  и  активизация  процессов  окислительного  фосфорилирования.

Межвитаминные  взаимодействия  в  процессах  накопления  витаминов  А  и  Е  у  кур  после  40  дней  потребления  с  кормом,  проявлялись  в  следующем:  увеличение  концентрации  витамина  А  в  печени  кур  в  3  и  4  группах  сопровождалось  снижением  концентрации  витамина  Е  в  2—3  раза.  Накопление  витамина  Е  в  печени  способствовало  росту  концентрации  витамина  А  (табл.  1).

Таблица  1.

Накопление  витаминов  А  и  Е  в  печени  кур  в  зависимости  от  их  поступления  в  организм  с  кормом  (возраст  220  дней,  M±m,  n=5)

Примечание:  *  —  p<0,05;  **  —  p<0,01  —  разница  достоверна  в  сравнении  с  показателями  1  группы

Наибольшее  содержание  витамина  А  в  печени  определено  у  кур  4  группы,  которые  получали  его  в  40-кратной  дозе  (400  тыс.  МЕ/кг  корма)  и  добавку  витамина  Е  (10  мг/кг  корма).  Одновременно  при  этом  происходило  снижение  концентрации  витамина  Е  в  печени  в  3,5  раза.  У  кур  7  группы,  которые  получали  20-кратную  дозу  витамина  Е  (200  мг/кг  корма)  и  рекомендованную  дозу  витамина  А  (10  тыс.  МЕ/кг),  концентрация  альфа-токоферола  в  печени  повысилась  почти  в  10  раз.

Накопление  витаминов  А  и  Е  в  печени  кур  повлияло  на  дыхательную  активность  митохондрий.  Снижение  скорости  окисления  2-оксоглутарата  V₂  на  46,7  %  (p<0,05)  отмечено  в  4-й  группе  кур  (табл.  2)  при  потреблении  ими  витамина  А  в  количестве  400  тыс.  МЕ/кг  и  снижении  концентрации  витамина  Е,  а  также  у  кур  5  группы,  которые  не  получали  добавку  витамина  Е  с  кормом.

Наивысшая  скорость  V₂  при  окислении  митохондриями  сукцината  была  определена  в  6  и  7  группах,  где  доза  витамина  Е  составляла  100  и  200  мг/кг,  соответственно,  а  доза  витамина  А  —  10  тыс.  МЕ/кг.  Так,  у  кур  7  группы  интенсивность  окисления  сукцината  повысилась  на  115,4  %,  а  в  6  группе  этот  показатель  повысился  на  78,9  %  (р<0,05).  У  кур  5  группы,  которые  не  получали  добавку  витамина  Е,  скорость  V₂  была  ниже,  чем  в  6  и  7  группах.

Таблица  2.

Показатели  дыхательной  активности  митохондрий  печени  кур  в  связи  с  потреблением  витаминов  А  и  Е  с  кормом  (возраст  220  дней,  M±m,  n=5)

Примечание:  *  —  p<0,05;  **  —  p<0,01  —  разница  достоверна  в  сравнении  с  показателями  1  группы

Сравнивая  скорости  окисления  2-оксоглутарата  V_днф  (в  присутствии  разобщителя  реакций  дыхания  и  фосфорилирования  динитрофенола  -  2,4-ДНФ)  следует  отметить,  что  высокая  скорость  была  установлена  в  6  и  7  группах,  где  дозы  витамина  Е  составляли  100  и  200  мг/кг.  Так,  у  кур  7  группы  Vднф  при  окислении  2-оксоглутарата  в  2,9  раз  превышала  контроль.  При  окислении  сукцината  максимальная  скорость  V_днф  в  данном  опыте  установлена  у  кур  6  группы.  Это  отображает  активизацию  свободного  окисления  субстратов,  как  2-оксоглутарата,  так  и  сукцината,  с  увеличением  концентрации  витамина  Е  в  печени  кур  в  7—10  раз.

Под  действием  витамина  А  также  происходило  увеличение  скорости  V_днф.  Так,  у  кур  3  группы  скорость  V_днф  при  окислении  2-оксоглутарата  повысилась  на  60,5  %  (р<0,05).  Следовательно,  накопление  в  течение  40  дней  витамина  А  в  печени  кур,  как  и  витамина  Е,  способствовало  активизации  свободного  окисления  субстратов.  Такие  изменения  скорости  окисления  субстратов  в  разобщённом  состоянии  происходили  при  общем  росте  дыхательной  активности  митохондрий  и  значительном  накопления  этих  витаминов  в  печени.

Следует  заметить,  что  в  отсутствие  добавки  витамина  А  (2  группа)  и  применении  витамина  Е  (10  мг/кг)  на  протяжении  40  дней,  концентрация  витаминов  А  и  Е  приближалась  к  показателям  контрольной  группы,  что  можно  объяснить  либо  эффективным  использованием  каротинов  корма,  либо  перераспределением  витамина  А  между  органами  птицы  и  более  активным  депонированием  в  печени  под  действием  витамина  Е.  Другая  ситуация  складывается  в  отсутствие  добавки  витамина  Е  и  применении  гарантирующей  добавки  витамина  А  —  10  тыс.  МЕ/кг  (5  группа):  значительно  снижается  дыхательный  контроль  при  окислении  сукцината  и  активизируется  свободное  окисление  2-оксоглутарата,  растут  скорости  V₄  и  V_днф.  Это  свидетельствует  о  потребности  в  витамине  Е  для  эффективного  сопряжения  процессов  дыхания  и  фосфорилирования.

Дыхательный  контроль  (ДК)  по  Ларди,  соотношение  скоростей  V₃  и  V₂,  характеризует  потенциальную  активность  дыхательной  цепи  в  условиях  наивысшего  сопряжения  дыхания  и  окислительного  фосфорилирования.  При  окислении  2-оксоглутарата  ДК  по  Ларди  повышался  как  под  действием  витамина  А  в  4  группе  (от  2,82  ед.  в  контроле  до  5,55  ед.),  так  и  под  действием  витамина  Е  в  7  группе  (от  2,82  ед.  до  4,36  ед.).

Если  сравнить  интенсивность  фосфорилирования  (ИФ)  2  группы  кур  и  показатели  3  и  4  групп,  которые  получали  100  и  400  тыс.  МЕ/кг  витамина  А,  то  можно  отметить,  что  ИФ  в  этих  группах  ниже,  чем  в  2  группе  (рис.  1).  Такие  изменения  могут  быть  связаны  со  значительным  уменьшением  концентрации  витамина  Е  в  печени.  Это  предположение  подтверждается  изменениями  ИФ  у  кур  5  и  6  групп.  Так,  при  окислении  2-оксоглутарата  митохондриями  печени,  ИФ  у  кур  6  группы  (доза  витамина  Е  100  мг/кг)  значительно  превышает  этот  показатель  в  5  группе  кур,  которые  не  получали  витамин  Е.

Рисунок  1.  Интенсивность  фосфорилирования  в  митохондриях  печени  кур  при  различном  содержании  А  и  Е  в  рационе

Эффективность  фосфорилирования  (АДФ/О)  при  окислении  2-оксоглутарата  митохондриями  снижалась,  на  40,4  %  (р<0,05),  в  5  группе  кур,  которые  не  получали  дополнительно  витамин  Е  (рис.  2).  Отмечено  позитивное  влияние  витаминов  А  и  Е  на  АДФ/О  при  окислении  обоих  субстратов  в  3  и  6  группах. 

Рисунок  2.  Эффективность  фосфорилирования  в  митохондриях  печени  кур  при  различном  содержании  витаминов  А  и  Е  в  рационе

Пик  концентрации  витаминов  А  и  Е  в  яичном  желтке  у  кур,  которые  получали  добавки  этих  витаминов  установлен  на  35-й  день  опыта  (рис.  3,  рис.  4).  Под  действием  высоких  доз  витамина  А  снижалось  накопление  витамина  Е  в  яичном  желтке.  Однако,  при  повышении  содержания  витамина  Е  в  желтке  —  концентрация  витамина  А  также  возростала.

Рисунок  3.  Динамика  накопления  витаминов  А  и  Е  в  яичном  желтке  от  4  группы  кур  (доза  витамина  А  —  400  тыс.  МЕ/кг)

Рисунок  4.  Динамика  накопления  витаминов  А  и  Е  в  яичном  желтке  от  7  группы  кур  (доза  витамина  Е  —  200  мг/кг)

Применение  витамина  А  в  рационе  кур-несушек  в  количестве  100  тыс.  МЕ/кг  корма  способствовало  активизации  окисления  2-оксоглутарата  митохондриями  печени  цыплят  суточного  возраста,  но  при  этом  у  цыплят  снижались  скорости  окисления  сукцината,  а  также  уменьшался  ДК.  При  применении  витамина  А  в  количестве  400  тыс.  МЕ/кг  корма  замедлялось  окисление  2-оксоглутарата  и  сукцината  в  митохондриях  печени  суточных  цыплят,  снижались  АДФ/О  и  ИФ.

В  результате  применения  в  рационе  кур-несушек  витамина  Е  в  20-кратной  дозе  (200  мг/кг  корма)  он  оказывал  неблагоприятное  влияние  на  тканевое  дыхание  в  печени  цыплят  суточного  возраста,  поскольку  активизировались  процессы  свободного  окисления  сукцината,  замедлилось  использование  митохондриями  2-оксоглутарата,  происходило  разобщение  процессов  дыхания  и  фосфорилирования.

Обсуждение  результатов.

Известно,  что  ретиноевая  кислота  найдена  в  составе  митохондриального  гена  GRIM-19,  определенного  как  фактор  апоптоза,  который  одновременно  кодирует  последовательность  субъединиц  I  комплекса  ДЦ-NADH:  убихинон-оксидоредуктазы  [7].  Следовательно,  активация  окисления  НАД-зависимых  субстратов,  в  частности  2-оксоглутарата,  под  действием  ретиноевой  кислоты  может  привести  к  избыточному  образованию  сукцината  и  стимуляции  его  свободного  окисления.  Следовательно,  повышение  дыхательной  активности  митохондрий  печени  кур,  установленное  в  наших  опытах,  может  быть  индуцировано  двумя  путями:  1)  в  результате  влияния  витамина  А  на  I  участок  ДЦ;  2)  его  воздействием  на  активность  ПОЛ  и  структуру  мембран.

Существует  предположение  [2],  что  витамин  Е  влияет  на  процессы  окислительного  фосфорилирования,  связанные  с  I  участком  ДЦ,  известно  о  его  взаимодействии  с  убихиноном  Q.  Однако  прямых  окислительно-восстановительных  взаимодействий  между  НАД  и  альфа-токоферолом  до  настоящего  времени  не  установлено.  Результаты  наших  исследований,  также,  отображают  влияние  витамина  Е  на  окисление  НАД-зависимого  субстрата  2-оксоглутарата  и,  в  частности,  процесс  окислительного  фосфорилирования  на  первом  этапе  работы  ДЦ.  Учитывая,  что  накопление  витамина  Е  в  печени  кур  сопровождалось  увеличением  концентрации  витамина  А,  то  стимуляция  окисления  2-оксоглутарата  может  быть  проявлением  межвитаминных  взаимодействий  и  связана  как  с  действием  витамина  Е,  так  и  влиянием  витамина  А  на  I  комплекс  дыхательной  цепи.

Выводы:

1.  Взаимодействия  витаминов  А  и  Е  при  одновременном  длительном  применении  их  в  рационе  кур  проявляются  в  дозозависимом  влиянии  на  энергетические  процессы  в  митохондриях  печени. 

2.  Совместное  применение  в  рационе  кур-несушек  витамина  Е,  в  количестве  100  мг/кг  и  витамина  А  —  10  тыс.  МЕ/кг  корма  на  протяжении  40  дней,  оказывает  стимулирующее  влияние  на  реакции  тканевого  дыхания  в  печени  кур  и  создаёт  возможность  обогащения  яиц  этими  витаминами.

3.  Витамины  А  и  Е,  накапливаясь  в  печени  цыплят  в  результате  потребления  их  курами-несушками  в  повышенных  дозах  (витамин  А  —  100  и  400  тыс.  МЕ/кг,  витамин  Е  —  200  мг/кг),  оказывают  негативное  влияние  на  энергетические  процессы  у  потомства. 

Список  литературы: 

1.Витамины  в  питании  животных  /  А.Р.  Вальдман,  П.Ф.  Сурай,  И.А.  Ионов,  Н.И.  Сахацкий.  Харьков:  РИП  Оригинал,  1993.  —  423  с. 

2.Донченко  Г.В.  Молекулярные  механизмы  влияния  витамина  Е  на  тканевое  дыхание  и  энергетический  обмен  //  Труды  V  Всесоюзного  биохимического  съезда.  М.,  —  1985.  —  Том  3.  —  С.  48—49. 

3.Ионов  И.А.  Обогащение  яиц  и  мяса  птицы  витамином  Е  //  Вісник  аграрної  науки.  —  1997.  —  №  10.  —  С.  48—51.

4.Карабанов  С.Е.  Нормы  кормления  птицы  различных  видовых  и  половозрастных  групп.  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://poultry-new.narod.ru/DOC/Doc1.htm#1.  (дата  обращения:  29.01.2014).

5.Критерии  и  методы  контроля  метаболизма  в  организме  животных  и  птиц:  справочное  пособие  [Под.  ред.  Ионов  И.А.].  Харьков:  Ин-т  животноводства  НААН,  2011.  —  377  с.

6.Лемешева  М.М.  Кормление  сельскохозяйственной  птицы.  Сумы:  Слобожанщина,  2003.  —  152  с. 

7.The  cell  death  regulator  GRIM-19  is  an  inhibitor  of  signal  transducer  and  activator  of  transcription  /  J.  Zhang,  J.  Yang,  S.K.  Roy  [at  all.]  //  Cell  Biology.  —  2003.  —  V.  100,  —  №  16.  —  P.  9342—9347. 

8.Higdon  J.  Vitamin  E  [Electronic  Resource]  /  J.  Higdon,  V.J.  Drake,  M.G.  Traber  //  Linus  Pauling  Institute,  Micronutrient  Information  Center,  Oregon  State  University.  —  Copyright  2008.  —  Mode  of  access:  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://lpi.oregonstate.edu/infocenter/vitamins/vitaminE/  Title  from  the  screen  (дата  обращения:  23.01.2014). 

9.Vitamin  A  [Electronic  Resource]  /  J.  Higdon,  V.J.  Drake,  J.  Mayer  /  [at  all.]  //  Linus  Pauling  Institute,  Oregon  State  University,  Micronutrient  Information  Center.  —  Copyright  2000-2014.  —  Mode  of  access:  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://lpi.oregonstate.edu/infocenter/vitamins/vitaminA/.  –  Title  from  the  screen  (дата  обращения:  29.01.2014).