БИОКОНВЕРСИЯ  ПОЛИСАХАРИДНЫХ  КОМПЛЕКСОВ  РАСТИТЕЛЬНЫХ  ОТХОДОВ  СЕЛЬСКОГО  ХОЗЯЙСТВА  БАЗИДИАЛЬНЫМИ  ГРИБАМИ

Абылаева  Бактыгул  Акматалиевна

канд.  биол.  наук,  доцент  Ошского  государственного  университета,  Республика  Кыргызстан  г.  Ош

E-mail:  bakt70@mail.ru

Отходы  растительного  сырья  сельского  хозяйства  являются  источником  загрязнения  окружающей  среды.  (нет  связи  между  первым  и  вторым  предложениями)  Но,  к  сожалению,  большая  часть  растительного  вещества  находится  в  форме  прочных  полимеров,  таких  как  целлюлоза,  гемицеллюлоза  и  лиг­нин,  которые  с  трудом  или  совсем  не  используются  животным  организ­мом  в  качестве  питательного  вещества.  Чтобы  улучшить  усвояемость  ком­понентов  растительного  сырья,  интенсивно  разрабатываются  физические,  химические  и  биологические  методы  деструкции  полимеров  и  конверсии  их  в  более  ценные  продукты  [4,  с.  90].

В  распаде  лигноцеллюлозы  (ЛЦС)  особое  место  принадлежит  базидиальным  грибам,  обладающим  мощной  ферментативной  системой,  быстрым  ростом  и  высокой  проникающей  способностью  в  нерастворимый  субстрат.

В  результате  ферментации  субстрат  обогащается  не  только  белком,  но  и  легко  усвояемыми  углеводами,  увеличение  содержания  которых  происходит  за  счет  деградации  гемицеллюлоз,  целлюлозы,  пектиновых  веществ  и  других  полисахаридов  [7,  с.  66—71].

Для  большинства  базидиомицетов  природными  субстратами  являются  древесина  и  различные  отходы  сельского  хозяйства  и  промышленности,  содержащие  лигноцеллюлозу  [5,  с.  15].

В  глубинной  ферментации  грибы  Fomes  fomentarius  и  Pleurotus  ostreatus  на  среде  с  различными  растительными  отходами  синтезируют  в  окружающую  среду  достаточно  большое  количество  углеводов.

Использование  растительных  отходов  после  получения  полисахаридных  комплексов  для  дальнейшей  переработки  и  повышения  качества  кормов,  т.  е.  безотходное  производство  является  весьма  актуальной  проблемой  биотехнологии.

Исходя  из  вышеизложенного,  целью  настоящего  исследования  явилось  изучение  фракционного  состава  полисахаридов,  производимых  некоторыми  местными  базидиальными  грибами  при  их  глубинном  культивировании.

Материалы  и  методы.  В  качестве  производного  материала  были  взяты  растительные  отходы:  кукурузные  початки  и  рисовая  солома.  Методы:  последовательная  экстракция  и  биотехнологические.

Экспериментальная  часть.  В  экспериментальной  работе  нами  были  использованы  местные  штаммы  базидиальных  грибов  Pleurotus  ostreatus  и  Fomes  fomentarius  относящиеся  к  порядкам  Agaricales  Aphillophorales,  выделенные  из  ствола  тополя  парковых  культур  г.  Ош.  В  процессе  проведения  скрининга  нами  было  отобраны  грибы,  как  активный  штамм  целлюлозоразрушающей  способности. 

Выделенные  грибы  культивировали  глубинным  способом  при  температуре  28⁰—30⁰С  в  конических  колбах  Эрленмейера  объемом  500  мл  с  200  мл  питательной  среды,  содержащей  1  %  растительного  отхода  и  2  %  пивного  сусла,  в  течение  30  суток.  Количества  биомассы  определяли  весовым  методом,  рН  —  универсальной  лакмусовой  бумагой.  Растительные  субстраты:  кукурузные  початки  и  рисовую  солому  отделяли  от  культуральной  жидкости,  тщательно  промывали  дистиллированной  водой  и  далее  определяли  в  них  содержание  углеводов,  трудно  и  легкогидролизуемых  полисахаридов  гемицеллюлозы.

Выделение  ВРПС.  Культуральную  жидкость  и  надосадочную  жидкость  упаривали  в  роторном  испарителе  до  половинного  объема  и  обрабатывали  четырехкратным  объемом  этанола.  Выпавший  осадок  отделяли,  промывали  ацетоном  для  обезвоживания  и  сушили  над  Р₂О₅  .

Выделение  ПВ.  Гомогенат  двукратно  экстрагировали  смесью  равных  объемов  0,5  %  растворами  из  щавелевой  кислоты  и  оксалата  аммония  (1:1)  при  температуре  70  ⁰С  в  течение  3  ч.  Экстракты  отделяли,  упаривали  до  половинного  объема  и  осаждали  этанолом.  Осадок  промывали  ацетоном  и  сушили  над  Р₂О₅.

Выделение  ГМЦ.  После  выделения  ПВ  остатки  сырья  обрабатывали  10  %-ным  раствором  КОН  при  комнатной  температуре  в  течение  24  ч.  фильтровали,  нейтрализовали  80  %-ным  СН₃СООН.  Выпавший  осадок  отделяли,  обезвоживали,  промывали  ацетоном.  Получили  ГМЦ-А.  Маточный  раствор  диализовали  дистиллированной  водой.  Диализат  упаривали  и  осаждали  этанолом,  осадок  промывали  ацетоном.  Получили  ГМЦ-Б.

Кислотный  гидролиз  полисахаридов.  Полисахариды  подвергали  гидролизу  2  н.  Н₂SО₄  на  кипящей  водяной  бане  в  течение  7—12  ч.  Гидролизаты  нейтрализовали  карбонатом  бария  и  после  удаления  бария  фильтровали  и  упаривали  в  вакууме  до  сиропа.  Продукты  гидролиза  исследовали  методом  тонкослойной  хроматографии  (ТСХ)  на  силуфоле  и  бумажной  хроматографии  (БХ)  [6,  с.  39]  на  бумаге  Filtrak  FN-1-11.  В  результате  обнаружили  галактозу,  глюкозу,  арабинозу,  ксилозу  и  уроновые  кислоты.

Результаты  и  обсуждение.  Для  последующей  полной  оценки  степени  утилизации  лигноцеллюлозных  отходов  грибами  Pleurotus  ostreatus  и  Fomes  fomentarius  изучали  химический  состав  растительных  субстратов,  используемых  в  настоящей  работе.  В  таблице  1  приведен  химический  состав  растительных  отходов  до  культивирования  грибов.

Таблица  1.

Содержание  полисахаридов  (%  от  с/в)  в  растительных  сельскохозяйственных  отходах  до  культивирования  грибов

Данные  таблицы  показывают,  что  содержание  полисахаридов  различно  и  наибольшее  содержание  водорастворимых  полисахаридов  и  гемицеллюлозы-Б  наблюдается  на  кукурузном  початке  и  составляют  11,2  %  и  ГМЦ-Б  3,7  %.  На  рисовой  соломе  содержится  меньшее  количество  полисахаридов  ВРПС,  ПВ  и  ГМЦ-Б  т.  е.  2,72  %,  1,92  %  и  2,9  %  соответственно,  а  ГМЦ-А  содержится  больше  чем  на  кукурузном  початке. 

Определенный  интерес  для  последующих  исследований  представляло  изучение  способности  указанных  грибов  разлагать  нативные  лигноцеллюлозные  растительные  отходы. 

При  выращивании  грибов  на  этих  субстратах  происходит  их  утилизация  с  образованием  биологически  ценных  и  активных  веществ.  В  процессе  роста  грибов  от  10  сут.  до  30  сут.  наблюдается  уменьшение  содержания  трудногидролизуемых  полисахаридов  [3,  с.  66].  По  окончании  роста  культуры,  мицелий  гриба  отделяли  от  культуральной  жидкости  и  гомогенизировали.  Углеводные  компоненты  полисахаридов  выделяли  по  схеме  1  [1,  с.  12]. 

Далее,  для  изучения  компонентного  состава  вне-  и  внутриклеточных  углеводов  были  выделены  полисахаридные  фракции:  водорастворимый  полисахарид  (ВРПС),  пектиновые  вещества  (ПВ)  и  гемицеллюлозы  (ГМЦ  А  и  ГМЦ  Б).

Для  определения  компонентного  состава  каждую  из  полученных  фракций  полисахаридов  подвергли  полному  кислотному  гидролизу  и  анализировали  методом  бумажной  (БХ)  и  тонкослойной  хроматографии  (ТСХ).  Определение  качественного  состава  полисахарида  из  культуральной  жидкости  показало,  что  он  состоит  из  следующих  основных  мономерных  единиц:  глюкозы,  ксилозы,  галактозы,  арабинозы,  маннозы,  рамнозы  и  галактуроновой  кислоты. 

В  таблице  2  приведено  содержание  углеводов  после  культивирования  грибов  на  растительных  отходах.

Таблица  2. 

Содержание  углеводов,  продуцируемых  базидиальными  грибами,  на  средах  с  различными  растительными  отходами

Примечание:  I  —  рисовая  солома,  II  —  кукурузные  початки,  НКЛ  —  из  культуральной  жидкости,  ВКЛ  —  из  гомогената  мицелия

Из  таблицы  видно,  что  по  сравнению  с  грибом  Fomes  fomentarius  гриб  Pleurotus  ostreatus  синтезирует  больше  полисахаридов.  Поэтому  для  получения  в  промышленных  объемах  желательно  использовать  грибы  рода  Pleurotus  ostreatus  По  данным  [2,  с.  935]  при  выращивании  грибов  на  растительных  отходах  происходит  расщепление  полисахаридов  до  моно-,  ди-  и  олигосахаридов  и  последние  индуцируют  биосинтез  соответствующих  ферментов.

Из  данных  таблицы  2  видно,  что  в  культуральной  жидкости,  полученной  на  среде  с  рисовой  соломой,  содержание  водорастворимых  полисахаридов  составляет  1,2  %—1,39  %.  Водорастворимые  полисахариды  представляют  собой  порошки  кремово-желтого  цвета,  хорошо  растворимые  в  воде.  Основным  продуктом  гидролиза  полисахаридов,  выращенных  на  среде  с  кукурузным  початком,  полученным  из  культуральной  жидкости  грибов  Pleurotus  ostreatus  и  Fomes  fomentarius  является  глюкоза.  В  гидролизатах  надосадочной  жидкости  полученных  от  всех  видов  грибов,  также  преобладает  глюкоза.

На  среде  с  рисовой  соломой  в  продуктах  гидролиза  полисахарида  из  надосадочной  жидкости  у  грибов  F.  Fomentarius,  также  обнаружена  в  основном  глюкоза.  С  грибом  P.  оstreatus  преобладает  ксилоза  и  глюкоза.  Пектиновое  вещество  преобладает  по  содержанию  на  среде  с  кукурузными  початками  —  2,6  %.  В  продуктах  гидролиза  пектиновых  веществ  методом  бумажной  хроматографии  обнаружены  галактоза,  глюкоза,  арабиноза,  манноза,  ксилоза  и  галактуроновая  кислота.

Гемицеллюлоза  представляет  собой  порошки  темно-коричневого  цвета,  хорошо  растворимые  в  щелочи.  Водные  растворы  гемицеллюлозы  не  дают  с  йодом  реакции  на  крахмал.  Содержание  гемицеллюлозы  на  среде  с  рисовой  соломой  высоко  —  4,16  %.  Среди  моносахаридов  гемицеллюлозы  —  А  на  среде  с  кукурузным  початком  и  на  среде  с  рисовой  соломой  преобладающими  компонентами  являются  глюкоза  и  ксилоза.

Таким  образом,  проведенные  эксперименты  показали,  что  растительные  отходы  сельского  хозяйства,  содержащие  разные  количества  лигноцеллюлозы,  активно  утилизируются  вышеуказанными  грибами,  способными  синтезировать  достаточное  количество  как  внеклеточных,  так  и  внутриклеточных  углеводов.  Среди  используемых  питательных  сред  благоприятной  средой  для  роста,  развития  и  синтеза  в  достаточном  количестве  углеводов  являются  кукурузные  початки.

Схема  выделения  микробных  полисахаридов

Схема  1.

Список  литературы:

1.Абылаева  Б.А.  Выделение,  очистка  и  характеристика  глюкана  из  базидиального  гриба  Fomes  fomentarius  Я  55./  канд.  Диссерт.  1998.  —  12  с.

2.Ахмедова  З.Р.,  Белецкая  О.П.,  Далимова  Г.Н.  //  Микробиология,  —  1994.  —  Т.  63.  —  Вып.  5.  —  935  с.

3.Ахмедова  З.Р.  Биодеградация  растительных  отходов  грибом.  Образование  биологически  ценных  продуктов  //  Биотехнология.  —  1992.  —  №  5.  —  66  с.

4.Бекер  М.Е.  Микробная  биоконверсия  растительного  сырья  и  перспективы  ее  использования.  Тезисы  докл.  Всесоюзн.  Симпозиума  «Биоконверсия  растительного  сырья».  Т.  1.  Рига,  1982.  —  90  с.

5.Даниляк  Н.И.,  Семичаевский  В.Д.,  Дудченко  Л.Г.,  Трутнева  И.А.  Ферментные  системы  высших  базидиомицетов.  Киев:  Наук.думка,  1989.  —  15  с.

6.Оводов  Ю.С.//Газо-жидкостная  хроматография  углеводов.  Владивосток.  1970.  —  39  с.

7.Стахеев  И.В.,  Костина  А.М.,  Бабицкая  В.Г.,  Щерба  В.В.  Углеводный  состав  препаратов  грибного  происхождения,  полученных  при  глубинном  и  поверхностном  выращивании  культур  //  Микробиология.  —  1986.  —  Т.  55.  —  Вып.  1.  —  66—71  с.