Republic  of  Kazakhstan,  Astana

Suleimen  Yerlan

candidate  of  Chem.  Science  ,  PhD,  Main  Researcher  of  the  Institute  of  Applied  Chemistry,  Associate  Professor  of  Chemistry  Department  of  L.N.  Gumilyov  Eurasian  National  University, 
Republic  of  Kazakhstan,  Astana

Iskakova  Zhanar

candidate  of  Chem.  Science,  Leading  Researcher

of  the  Institute  of  Applied  Chemistry  of  L.N.  Gumilyov  Eurasian  National  University, 
Republic  of  Kazakhstan,  Astana

Akatan  Kydyrmolla

master  of  chem.  engineer-   researcher  of  the  lab.  NMR  spectroscopy  of  S.  Amanzholov  East  Kazakhstan  State  University, 
Republic  of  Kazakhstan,  Oskemen

Аннотация

Проведена  химическая  модификация  кверцетина  с  помощью  реакций  хлорирования,  этерификации  стеариновой  кислотой  и  тозилирования.  Строение  тозильного  производного  подтверждено  спектральными  методами.  Изучена  цитотоксическая  активность  исходного  кверцетина,  антиоксидантная  активность  тозильного  производного.

ABSTRACT

Using  reactions  of  chlorination,  esterification  with  stearic  acid  and  tosylation  chemical  modification  of  quercetin  was  realized.  The  structure  of  the  obtained  tosyl  derivative  was  established  by  spectral  methods.  Cytotoxic  activity  of  quercetin  and  antioxidant  activity  of  tosyl  derivative  were  studied.

Ключевые  слова:  кверцетин;  ¹Н  ЯМР;  стеарат  кверцетина;  тетратозилат;  цитотоксическая  активность;  DPPH.

Keywords:  quercetin;  ¹H  NMR;  stearate  of  quercetin;  tetratosylate;  cytotoxic  activity;  DPPH.

Встречающийся  во  многих  растениях  флаваноид  кверцетин  (1)  относится  к  полифенольным  соединениям  и  является  вторичным  метаболитом.  Он  широко  распространен  в  таких  продуктах  как  овощи,  фрукты,  чай  и  вино,  а  также  в  многочисленных  пищевых  добавках,  и  оказывает  благотворное  воздействие  на  здоровье  человека  [8].  Способность  кверцетина  (1)  захватывать  пероксинитриты  и  гидроксильные  радикалы,  обладающие  высокой  реакционной  способностью,  является  доказательством  обладания  протекторного  свойства  [5;  7].  Биохимическая  активность  кверцетина  (1)  хорошо  документированы.  Это  один  из  самых  мощных  антиоксидантов  среди  полифенолов  [4;  9;  10].  Также  были  продемонстрированы  его  противовирусные,  антибактериальные,  противораковые  и  противовоспалительные  эффекты  [2;  4;  6].  Антиканцерогенные  свойства  кверцетина  (1)  проявляются  за  счет  его  значительного  воздействия  на  увеличение  апоптоза  в  мутантных  клетках,  ингибирование  синтеза  ДНК,  ингибирование  роста  раковых  клеток,  снижение  и  модификация  сотовой  сигнальной  трансдукции  [3].

Очистка  кверцетина   (1)

Для  определения  чистоты  кверцетина  (1)  был  снят  его  ¹Н  ЯМР  спектр  в  ДМСО.  По  данным  спектрального  анализа  выяснилось  загрязненность  кверцетина  рутином.

Определение  количества  компонентов  в  смеси  с  кверцетином  (1)  проводили  с  применением  метода  тонкослойной  хроматографии  в  системе  растворителей:  этилацетат-уксусная  кислота-вода  в  соотношении  18:1:1.  Пластины  проявляли  УФ-ом  и  насыщенным  раствором  хлорида  железа  (III).  После  проявления  детектором  на  хроматограмме  было  обнаружено  наличие  2  окрашенных  в  зеленый  цвет  зон:  R_f  =  0,25  (рутин)  и  R_f  =  0,75  (кверцетин  (1)).

Очистку  кверцетина  (1)  проводили  гель-фильтрацией  на  колонке.  В  качестве  неподвижной  фазы  использовали  микропористый  материал  Sephadex  LH-20,  представляющий  собой  декстран,  молекулы  которого  соединены  химическими  связями.  В  качестве  элюента  применяли  этиловый  спирт.  Массовое  отношение  смеси  разделяемых  веществ  к  сорбенту  было  взято  в  соотношении  1:100.  В  процессе  разделения  было  зафиксировано  образование  отдельных  друг  от  друга  двух  окрашенных  в  желтый  цвет  зон.  Фракции  собирали  визуально  по  образовавшимся  окрашенным  зонам.  При  детектировании  полученных  фракций  на  ТСХ  хроматограмме  подтвердилось  разделение  двух  соединений.

¹ Н  ЯМР-спектр  молекулы  кверцетина  (1)  представлен  в  таблице  1  и  соответствует  литературным  данным  [1].

Таблица  1. 

Данные  ЯМР  ¹Н  (500  МГц,  ДМСО,  δ,  м.д.,  J/Гц)  молекулы  кверцетина  (1)

Химическая  модификация  кв ерцетина  (1)

·     Реакция  хлорирования  кверцетина  (1)  газообразным  хлором

Хлорпроизводные  3,5,7,3',4'  —  пентагидроксифлавона  получали  реакцией  газообразного  хлора  с  кверцетином  (1)  в  смеси  органических  растворителей  хлороформ-этанол,  взятых  в  равных  соотношениях.  Газообразный  хлор  вводили  в  реакционную  систему  сразу  после  получения  его  реакцией  между  перманганатом  калия  и  концентрированной  соляной  кислотой.  В  результате  были  получены  предположительно  два  хлорпроизводных  кверцетина  (6-монохлоро-(2)  (R_f  =  0,78),  6,8-дихлорокверцетин  (3)  (R_f  =  0,85)),  которые  зафиксировали  с  помощью  ТСХ  (рисунок  1).  Реакция  проходила  с  изменением  цвета  раствора  с  бледно  желтого  на  кроваво-красный.  Предложен  механизм  реакции,  согласно  которой  способность  к  электрофильной  атаке  молекулами  хлора  2',5',6',6,8-положений  связана  с  мезомерным  эффектом  между  неподеленной  парой  электронов  атома  кислорода  гидроксильной  группы  и  π-электронами  бензольного  кольца  (р,  π  -  коньюгация).

Получение  хлора:

2KMnO₄  +  16  HCI  =  2KCI  +  2MnCI₂  +  5CI₂  +  8H₂O

Рисунок  1.  Получение  хлорпроизводных   кверцетина

·     Реакция  этерификации  кверцетина  (1)  со  стеариновой  кислотой

Синтез  производного  кверцетина  (1)  со  стеариновой  кислотой  проводили  в  атмосфере  аргона,  применяя  катализаторы  DMAP  (4-диметиламинопиридин)  и  EDC  (1-этил-3(3-диметиламинопропил)  карбодиимид  гидрохлорид),  использующиеся  для  связывания  кислоты  со  спиртовой  группой.  В  качестве  растворителя  применяли  тетрагидрофуран  (ТГФ).  Реакцию  проводили  в  течение  18  часов  при  25  ^оС.

18,78  мг  (0,066  ммоль)  стеариновой  кислоты,  растворенный  в  2  мл  ТГФ,  прилили  в  реакционную  колбу  с  инертной  средой,  куда  предварительно  внесли  20  мг  (0,066  ммоль)  кверцетина  (1)  и  4  мг  (0,033  ммоль)  DMAP.  Содержимое  колбы  тщательно  перемешивали  до  полного  растворения  веществ.  К  реакционной  системе  добавили  растворенный  в  3  мл  ТГФ  19  мг  (0,1  ммоль)  EDC.  Ход  реакции  контролировали  методом  ТСХ.  В  результате  был  получен  продукт  стеарат  кверцетина  (4)  с  R_f  =  0,85  (рисунок  2).

После  завершения  реакции  к  реакционной  смеси  прилили  50  мл  дистиллированной  воды  и  экстрагировали  50  мл  этилацетата.  Органическую  фазу  высушивали  над  Na₂SO₄,  отфильтровали  и  концентрировали  на  роторном  испарителе.  Концентрат  делили  на  колонке  с  силикагелем.  Продукт  реакции  не  удалось  выделить  из-за  нестабильности  соединения  (4),  разлагающегося  в  процессе  очистки.

Рисунок  2.  Получение  производного  кверцетина  (4)  со  стеариновой  кислотой

·     Получение  тозильного  производного  кверцетина

Реакцию  кверцетина  с  п-толуолсульфохлоридом  проводили  в  DMF,  в  присутствии  K₂CO₃.  Реакция  проходила  при  комнатной  температуре  в  течение  4,5  ч.  В  результате  была  получены  смесь  тозильных  производных  кверцетина.  Применяя  хроматографию  удалось  выделить  тетратозилат  кверцетина  (5),  химическая  стуктура  которого  установлена  спектральными  методами.

Рисунок  3.  Получение  тетратозилата  кверцетина

·     Синтез  тетратозилата  кверцетина  (5):

Прогресс  реакции  кверцетина  с  п-толуолсульфохлоридом  фиксировали  с  применением  ТСХ  в  смеси  растворителей  этанол-хлороформ,  взятых  в  соотношении  1:16.  Детектирование  соединений  на  ТСХ  пластинке  проводили  с  помощью  УФ  и  насыщенного  раствора  FeCl₃.  Колоночную  хроматографиию  смеси  продуктов  проводили  градиентным  элюированием  смесью  растворителей  гексан-этилацетат.  Т.пл.  определяли  на  SRS  OptiMelt  (Automated  Melting  Point  System).  ИК-спектры  получены  на  приборе  «Cary  600  FT  IR».  Спектры  ЯМР  записаны  на  спектрометре  «Bruker  DRX-500»  (рабочая  частота  —  500  МГц  для  ¹Н,  125,7  МГц  для  ¹³С).

Методика  проведения  реакции:  К  раствору  кверцетина  (1)  (150  мг,  0,5  ммоль,  1  экв)  в  ДМФ  (20  мл)  добавляли  при  комнатной  температуре  карбонат  калия  (1371,8  мг,  10  ммоль,  20  экв)  и  тозилхлорид  (662,3  мг,  3,5  ммоль,  7  экв).  После  4,5  ч  реакции,  к  реакционной  смеси  прилили  дистиллированную  воду  (75  мл).  Продукты  реакции  экстрагировали  этилацетатом  (50  мл  х  7).  Объединенные  органические  фазы  промыли  10%-ым  раствором  NaCl  (100  мл),  высушили  над  Na₂SO₄,  отфильтровали  и  концентрировали  на  роторном  испарителе.  Смесь  продуктов  делили  на  колонке  с  силикагелем.  При  элюировании  30  %-ым  этилацетатом  в  гексане  выделили  кристаллы  с  желтоватым  оттенком,  5-гидрокси–3,7,3',4'-тетратозилфлавон  (60  мг,  13  %).  Т_пл=191,5  ^oС.

ИК -спектр  (ν,  cм^-1):  1650  (C=O),  1350  (O-SO₂),  1090  (S=O).

¹ Н  ЯМР-спектр  (δ,  500  МГц,  СDCl₃):  данные  представлены  в  таблице  1  (рис.  4).

¹³ С  ЯМР-спектр  (δ,  125,7  МГц,  СDCl₃):  данные  представлен  в  таблице  1  (рис.  5).

Количество  тозильных  групп  определяли  по  ингеральным  ПМР  спектра.

Корреляцию  спектров  проводили  с  использованием  ¹³С  Dept  и  двумерных  спектров  ¹Н-¹Н  (COSY),  ¹Н-¹³C  (HSQC  и  HMBC).

Таблица  1. 

Данные  ЯМР  ¹Н  (500  МГц,  СDCl₃,  δ,  м.д.,  J/Гц)  и  ¹³С  (120  МГц,  СDCl₃,  δ,  м.д.)  молекулы  (5)

Рисунок  6.  ¹Н  ЯМР  спектр  5-гидрокси  –  3,7,3',4'-  тетратозилфлавона

Рисунок  7.  ¹³С  ЯМР  спектр  5-гидрокси  –  3,7,3',4'-  тетратозилфлавона

Определение  биологической  активности 

·     Цитотоксическая  активность  кверцетина  (1).

Нами  было  проведено  исследование  исходного  кверцетина  на  цитотоксическую  активность.

Методика  определение  цитотоксической  активности.  Делительную  воронку  на  55  мл  заполняли  искусственной  морской  водой  и  добавляли  200  мг  яиц  Artemia  salina.  Выдерживали  в  течение  3-х  дней  при  мягкой  подаче  воздуха,  пока  рачки  не  выведутся  из  яиц.  Одну  сторону  трубы  покрывали  алюминиевой  фольгой,  и  5  мин  спустя  личинки,  которые  собирались  на  яркой  стороне  делительной  воронки,  вынимали  пипеткой  Пастера.

20—40  личинок  помещали  в  990  мл  морской  воды  в  каждой  из  24  микроплошек.  Подсчитывали  мертвых  личинок  под  микроскопом.  Добавляли  по  10  мл  раствора  диметилсульфоксида  на  10  мг/мл  образца.  В  качестве  препарата  сравнения  использовали  актиномицин  Д  или  стауроспорин.  Для  отрицательного  контроля  добавляли  только  10  мл  ДМСО.  После  24  ч  инкубации  и  дальнейшего  выдерживания  микроплошки  в  течение  24  ч  (для  обеспечения  неподвижности)  подсчитывали  мертвые  личинки  под  микроскопом. 

Смертность  P  определяли  по  формуле  1:

Р  =  ( A  -  N  -  B)/Z  ×  1000

где:  A  —  количество  мертвых  личинок  после  24  ч;

N  —  количество  мертвых  личинок  до  проведения  теста;

B  —  среднее  количество  мертвых  личинок  в  отрицательном  контроле;

Z  —  общее  количество  личинок.

Данные  по  цитотоксической  активности  кверцетина  (1)  приведены  в  таблице  2. 

Таблица  2 .

Результаты  определения  цитотоксической  активности

На  основании  проведенного  эксперимента  можно  предположить,  что  кверцетин  (1)  во  всех  концентрациях  не  проявляет  цитотоксическую  активность.

·     Антиоксидантная  активность  тозильного  производного  кверцетина  (5).

Изучена  антиоксидантная  активность  синтезированного  тозильного  производного  кверцетина  (5)  DPPH  и  FRAP  методами. 

Методика  DPPH  исследования.  Для  определения  ингибирования  2,2-дифенил-1-пикрилгидразилрадикала  (DPPH)  к  0,1  мл  исследуемого  образца  в  диапазоне  концентраций  0,1;  0,25;  0,5;  0,75;  1  мг/мл  добавляли  3  мл  6×10‾⁵М  раствора  радикала.  Центрифужные  пробирки  находились  в  штативе,  завернутого  в  черный  полиэтилен.  После  интенсивного  перемешивания  растворы  оставлялись  в  темноте  и  через  30  минут  производили  измерение  оптической  плотности  при  длине  волны  520  нм.  Значения  величины  антирадикальной  активности  (АРА)  исследуемого  соединения  (5)  определяли  по  формуле  2:

АРА  (%)=А₀-А _t  /А₀×100

где:  А₀  —  оптическая  плотность  контрольной  пробы;

А_t  —  оптическая  плотность  рабочего  раствора.

Измерение  оптической  плотности  исследуемого  соединения  (5)  производили  при  520  нм  на  приборе  Cary  60  UV-Vis.  Антирадикальную  активность  тетратозилата  кверцетина  (5)  сравнивали  с  антирадикальной  активностью  бутилгидроксианизола  (BHA).  Значения  антирадикального  эффекта,  рассчитанные  по  формуле  2,  приведены  в  таблице  3.

Таблица  3.

Антирадикальная  активность  (%)  5-гидрокси  —  3,7,3',4'-тетратозилфлавона  (5)  при  разных  концентрациях

На  основании  анализа  данных  таблицы  3  и  графика  (рис.  6)  видно,  что  все  исследованные  растворы  вещества  (5)  имеют  низкую  антирадикальную  активность  по  сравнению  с  ВНА. 

Рисунок  6.  Динамика  антирадикальной  активности  при  изменении  концентрации  веществ

Определение  железо-восстанавливающего  потенциала  исследуемых  образцов  FRAP-методом  (Ferric  Reducing  Antioxidant  Powerassay).  К  0,1  мл  исследуемого  вещества  (5)  в  диапазоне  концентраций  0,25;  0,5;  0,75;  1,0  мг/мл  добавляли  0,25  мл  0,2  М  фосфатного  буфера  (рН=6,6)  и  0,25  мл  1  %  раствора  гексацианоферрата  (III)  калия.  Реакционная  смесь  инкубировали  в  течение  20  мин.  при  50  ⁰С,  реакцию  останавливали  добавлением  0,25  мл  10  %  раствора  трихлоруксусной  кислоты.  Смесь  центрифугировали  10  мин.  (3000  обор./мин.).  Верхний  слой  объемом  0,5  мл  смешивали  с  0,5  мл  дистиллированной  воды  и  0,1  мл  0,1  %  FeCl₃.  Измерение  оптической  плотности  (ОП)  производили  при  700  нм.  Антиоксидантную  активность  (АОА)  5-гидрокси  —  3,7,3',4'-  тетратозилфлавона  (5)  сравнивали  с  АОА  бутилгидроксианизола  (ВНА).

Таблица  4.

Изменение  ОП  растворов  в  зависимости  от  концентрации  рабочих  растворов

Рисунок  7.  Влияние  концентрации  веществ  на  изменение  антиоксидантной  активности

На  основании  анализа  данных  таблицы  4  и  графика  (рис.  7)  видно,  что  исследованное  вещество  (5)  во  всех  концентрациях  имеет  низкую  АОА  по  сравнению  с  бутилгидроксианизолом.

Список  литературы:

1.Прибыткова  Л.Н.,  Адекенов  С.М.  Флавоноиды  растений  рода  Artemisia  L.  Алматы:  Гылым,  1999.  —  180  с.

2.Di  Carlo  G.,  Mascolo  N.,  Izzo  A.A.,  Capasso  F.  Flavonoids:  old  and  new  aspects  of  a  class  of  natural  therapeutic  drugs  //  Life  Sci.  —  1999.  —  №  65.  —  P.  337—353.

3.Erkoc  S.,  Erkoc  F.,  Keskin  N.  Theoretical  investigation  of  quercetin  and  its  radical  isomers  //  J.  Mol.  Struct.  —  2003.  —  №  631.  —  P.  141—146.

4.Formica  J.F.,  Regelson  W.  Review  of  the  biology  of  quercetin  and  related  bioflavonoids  //  Food  Chem.  Tox.  —  1995.  —  №  33.  —  P.  1061—1080.

5.Hanasaki  Y.,  Ogawa  S.,  Fukui  S.  The  correlation  between  active  oxygens  scavenging  and  antioxidative  effects  of  flavonoids  //  Free  Radic.  Boil.  Med.  —  1994.  —  №  16.  —  P.  845—850.

6.Harborne  J.B.,  Williams  Ch.A.  Advances  in  flavonoid  research  since  1992  //  Phytochemistry.  —  2000.  —  №  55.  —  P.  481—504.

7.Heijen  C.G.,  Haenen  G.R.M.M.,  van  Acker  F.A.,  van  der  Vijgh  W.J.,  Bast  A.  Flavonoids  as  peroxynitrite  scavengers:  the  role  of  the  hydroxyl  groups  //  Toxicol.  In  Vitro.  —  2001.  —  №  15.  —  P.  3—6.

8.Kaur  Ch.,  Kapoor  H.C.  Antioxidants  in  fruits  and  vegetables  –  the  millennium’s  health  //  Int.  J.  Food  Sci.  Technol.  —  2001.  —  №  36.  —  P.  703—725.

9.Prior  R.L.  Fruits  and  vegetables  in  the  prevention  of  cellular  oxidative  damage  //  Am.  J.  Clin.  Nutr.  —  2003.  —  №  78.  —  P.  570—578.

10.Rice-Evans  C.A.,  Miller  J.,  Paganga  G.  Antioxidant  properties  of  phenolic  compounds  //  Trends  Plant  Sci.  —  1997.  —  №  4.  —  P.  152—159.