РАЗРАБОТКА  МИКРОБНОГО  БИОПРЕПАРАТА  НА  ОСНОВЕ  МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ  ПОЛИМЕРСОДЕРЖАЩИХ  ОТХОДОВ

Каширская  Анна  Олеговна

аспирант  ФГБОУ  ВПО  «Астраханский  государственный  технический  университет»,  РФ,  г.  Астрахань

E-mail:  

DEVELOPMENT  OF  MICROBIAL  INOCULANTS  BASED  TO  DESTRUCTOR  MICROORGANISMS  OF  POLYMER-WASTE

Kashirskaya   Anna

graduate  student  of  Astrakhan  state  technical  university,  Russia,  Astrakhan

АННОТАЦИЯ

Изучение  возможности  биодеструкции  полимерсодержащих  отходов  микроорганизмами  в  настоящее  время  является  актуальным  вопросом  из-за  накопления  в  биосфере  сложных  химических  веществ  полимерной  природы.  В  модельном  эксперименте  выделено  стабильное  сообщество  бактерий,  микромицетов,  являющихся  потенциальными  деструкторами  полимерсодержащих  отходов,  что  подтверждено  определением  наличия  побочных  продуктов  распада  полиэтилена  в  модельных  экосистемах. 

ABSTRACT

To  study  the  possibility  of  biodegradation  of  polymer  waste  microorganisms  currently  a  topical  issue  of-due  to  the  accumulation  in  the  biosphere  complex  chemical  nature  of  the  polymer.  In  the  model  experiment  allocated  stable  community  of  bacteria  and  micromycetes  are  potential  destructors  of  polymer  waste,  which  was  confirmed  by  determination  of  the  presence  of  polyethylene  byproducts  decay  in  model  ecosystems.

Ключевые  слова:   биодеградация;  полимеры;  полиэтилен;  микроорганизмы;  биотестирование.

Keywords:   biodegradation;  polymers;  polyethylene;  microorganisms;  biological  testing.

Особую  актуальность  деструкционная  способность  микроорганизмов  приобрела  в  последние  десятилетия  в  связи  с  возрастающим  количеством  в  биосфере  устойчивых  загрязнителей  антропогенного  происхождения,  в  том  числе,  полимерных  отходов  и  материалов.  Поиск  высокоактивных  микроорганизмов  —  деструкторов  полимерсодержащих  отходов,  обладающих  различными  ферментными  системами  и  широким  спектром  метаболических  процессов,  является  актуальным  вопросом  [2,  с.  35].

В  большинстве  регионов  России,  в  том  числе  и  в  Астраханской  области,  не  производится  вторичная  переработка  полимерсодержащих  отходов.  Они  собираются  и  накапливаются  на  мусорных  полигонах,  вследствие  чего  происходит  загрязнение  окружающей  среды  соединениями,  относящимися  к  стойким  органическим  загрязнителям.  В  процессе  хранения  таких  отходов  в  окружающую  среду  выделяется  большое  количество  побочных  продуктов  распада  полимеров,  содержащих  органические  кислоты,  карбонильные  соединения,  в  том  числе,  формальдегид,  ацетальдегид  и  окись  углерода,  что  негативно  отражается  на  экологическом  состоянии  окружающей  среды.

Целью  работы  являлось  изучение  возможности  разложения  полимерных  материалов  при  помощи  микроорганизмов,  способных  использовать  углерод,  входящий  в  состав  полимерных  материалов,  в  процессах  метаболизма,  роста  и  размножения.

Материалы  и  методы  исследования

Выделение  микроорганизмов  —  деструкторов  осуществляли  методом  накопительной  культуры  (НК)  на  основе  минеральной  синтетической  среды  с  внесением  полиэтилена  как  основного  загрязнителя.

Экспозицию  проводили  в  течение  82  месяцев,  в  ходе  которой  периодически  определяли  качественный  и  количественный  состав  сформировавшихся  в  модельной  экосистеме  сообществ.

Определение  продуктов  распада  при  деструкции  полимерных  материалов  в  накопительной  культуре  проводили  качественными  химическими  реакциями  на  определение  продуктов  деградации  полимеров.  Для  обнаружения  вторичных  и  третичных  спиртов  —  пробу  Лукаса,  на  наличие  этилового  спирта  —  йодоформную  пробу,  для  обнаружения  белков,  содержащих  в  своем  составе  ароматические  аминокислоты  —  ксантопротеиновую  реакцию,  для  обнаружения  в  растворе  веществ,  содержащих  в  своем  составе  пептидную  связь  —  Биуретовую  реакцию  [7,  с.  44]. 

Получение  чистых  культур  и  идентификацию  микроорганизмов  производили  с  использованием  общепринятых  методов  и  определителей  микромицетов  Д.  Саттона  [6,  с.  126—299]  и  бактерий  Берджи  [5,  с.  412—422].

Предварительный  скрининг  изолированных  в  чистые  культуры  микроорганизмов  на  наличие  ферментов  проводили  методом  качественных  реакций  по  определению  ферментативных  активностей  (липолитическая,  амилолитическая,  казеиназная,  желатиназная,  пектолитическая,  целлюлозолитическая),  являющихся  катализаторами  деструкции  различных  сложных  химических  веществ  до  более  простых  (коллаген,  казеин,  крахмал,  пектиновые  вещества,  триглицериды,  целлюлоза).  Оценка  активностей  производилась  на  2-е  и  7-е  сутки  культивирования  микроорганизмов  по  трехбалльной  шкале  [1,  с.  71—76;  4,  с.  337—350]. 

Результаты  и  обсуждение

При  длительном  культивировании  накопительной  культуры  установлено,  что  на  начальном  этапе  (1—2  месяца)  в  её  составе  обнаруживаются  единичные  представители  всех  исследуемых  физиологических  групп  микроорганизмов.  На  II  этапе  (4—36  месяцев)  численность  микроорганизмов,  усваивающих  органическую  форму  азота,  постепенно  снижалась  и  по  окончании  36  месяцев  культивирования  уменьшилась  в  10  раз.  Численность  микроорганизмов,  усваивающих  минеральную  форму  азота,  в  данный  период  наблюдений  увеличилась  незначительно  1  порядка  (32—82  КОЕ/мл),  численность  олиготрофных  микроорганизмов  так  же  увеличивалась,  но  по  истечении  этапа  культивирования  (36  месяцев)  снизилась  в  2  раза  по  сравнению  с  начальными  показателями.  На  III  этапе  экспозиции  (60—82  месяцев)  численность  всех  исследуемых  групп  микроорганизмов  возросла  по  сравнению  с  предыдущими  контрольными  точками  наблюдений:  микроорганизмов,  усваивающих  органическую  и  минеральную  форму  азота  на  3  порядка,  олиготрофов  на  2  порядка  (рис.  1).

Рисунок  1.  Численность  физиологических  групп  микроорганизмов,  выделенных  из  накопительной  культуры

При  экспозиции  накопительной  культуры  на  протяжении  всего  периода  наблюдали  смену  количественного  состава  (рис.  1),  тогда  как  качественный  состав  сообщества  оставался  стабильным  практически  на  протяжении  всего  периода  культивирования  модельной  экосистемы  (рис.  2).

а

б

в

Рисунок  2.  Соотношение  видов  микроорганизмов,  выделенных  из  модельной  экосистемы  в  период  наблюдений  (а  —  микроорганизмы,  усваивающие  органический  азот,  б  —  микроорганизмы,  усваивающие  минеральный  азот,  в  —  олиготрофы),  %

В  составе  сообщества  микроорганизмов  идентифицированы  представители,  предположительно  относящиеся  к  родам  Aspergillus,  Penicillium,  Alternaria,  Paecilomyces,  Trichoderma,  Scopulariopsis,  Bipolaris,  Pseudomonas,  Bacillus,  Micrococcus  [5,  с.  412—422;  6,  с.  126—299],  на  основе  которых  была  создана  коллекция  микроорганизмов  —  деструкторов.  Полученные  чистые  культуры  микроорганизмов  по  имеющимся  литературным  данным  способны  участвовать  в  процессах  биодеструкции  полимерных  отходов  [3,  с.  85—87].

При  изучении  ферментативной  активности  исследуемых  микроорганизмов  особое  внимание  уделяли  видам,  выделенным  с  базовой  среды  с  гомогенизированным  полиэтиленом.  После  обработки  полученных  данных  установили,  что  максимальным  спектром  активностей  на  базовой  среде  с  полиэтиленом  обладают  нейтрофильные  формы  B.  circulans  1,  Ps.  рutidа;  ацидофильные  формы  A.  flavus,  A.  fumigatus,  B.  circulans  2;  алкалофильные  формы  P.  chrysogenum,  B.  megaterium,  B.  polymyxa. 

Установили,  что  виды  A.  nidulans,  Alt.  аlternata,  Paec.  carneus  являются  толерантными,  т.  к.  выделенные  формы  микроорганизмов  проявляют  высокую  ферментативную  активность  в  достаточно  широком  диапазоне  реакции  среды  (рН  =  5-11). 

В  результате  все  периода  культивирования  из  накопительной  культуры  с  полимерсодержащим  материалом  было  выделено  и  идентифицировано  стабильное  сообщество  микроорганизмов  —  деструкторов  (бактерии,  микромицеты).

На  основании  предварительных  результатов  установлено,  что  выделенные  микроорганизмы  обладают  набором  ферментов,  которые  могут  воздействовать  на  сложные  связи  в  разветвленной  молекуле  полиэтилена,  способствуя  его  деструкции.

При  определении  наличия  в  накопительной  культуре  продуктов  распада  полимерных  материалов  путем  проведения  качественных  химических  реакций,  были  обнаружены  вторичные  и  третичные  спирты,  ароматические  аминокислоты,  что  может  свидетельствовать  о  протекании  процесса  биодеструкции  полимерсодержащего  материала  микроорганизмами  в  составе  накопительной  культуры.

Список  литературы:

1.Авсюк  И.В.  Избранные  задачи  большого  практикума  по  микробиологии:  методическое  пособие  /  И.В.  Авсюк ,  М.А.  Аль-Нури ,  Л.И.  Воробьева .  М.:  Изд-во  МГУ,  1991.  —  125  с.  —  ISBN  5-2110-2366-8.

2.Бояндин  А.Н.  Биодеградация  полигидроксиалканоатов  почвенными  микробиоценозами  различной  структуры  и  выявление  микроорганизмов-деструкторов:  научный  журнал  /  А.Н.  Бояндин,  С.В.  Прудникова  //  Прикладная  биохимия  и  микробиология.  М.,  —  2012.  —  Т.  48,  —  №  1.  —  С.  35—44. 

3.Каширская  А.О.  Микроорганизмы,  выделенные  с  поверхности  синтетических  полимерных  материалов  //  Проблемы  современной  биологии:  материалы  II  Международной  научно-практической  конференции  М.:  Спутник  +,  2011.  —  228  с.  —  С.  85—87. 

4.Нетрусов  А.И.  Практикум  по  микробиологии  /  А.И.  Нетрусов,  М.А.  Егорова,  Л.М.  Захарчук.  М.:  Академия,  2005.  —  608  с.;  —  ISBN:  576-9-518-09-X.

5.Определитель  бактерий  Берджи  :  В  2-х  т.  /Под  ред.  Дж.  Хоула,  Н.  Крига,  П.  Снита,  Дж  Стейли,  С.  Уилльямса.  М.:  Мир,  1997.  —  800  с.  —  ISBN  5-03-003112.

6.Саттон  Д.  Определитель  патогенных  и  условно-патогенных  грибов:  руководство-атлас  по  идентификации  /  Д.  Саттон,  А.  Форегилл,  М.  Ринальди  ;  пер.  с  англ.  ;  под  ред.  доктора  мед.  наук  И.Р.  Рожковой.  М.  :  Мир,  2001.  —  486  с.  —  ISBN  5-03-003308-4.

7.Шейко  Л.М.  Практикум  по  медицинской  и  биологической  физике  :  методическое  пособие  /Л.М.  Шейко,  С.Б.  Бокуть.  Минск  :  Изд-во  МГЭУ,  2011.  —  64  с.  —  ISBN  978-985-551-007-0.