ИССЛЕДОВАНИ Е  БИОЛОГИЧЕСКОЙ  АКТИВНОСТИ  И  АНАТОМИЧЕСКОГО  СТРОЕНИЯ  ARTEMISIA  TSCHERNIEVIANA  BESSER  ИЗ  КАЗАХСТАНА

Сисенғалиева  Гүлсана  Ғалымжанқызы

младший  научный  сотрудник  института  прикладной  химии,  студентка  4  курса  специальности  химия  ЕНУ  им.  Л.Н.  Гумилева,  Республика  Казахстан,  г.  Астана

Е-mail: 

">gulok_93_3mail.ru

Ишмуратова  Маргарита  Юлаевна

канд.  биол .  наук,  доцент  кафедры  фармацевтических  дисциплин  Карагандинского  университета  «Болашак»,  Республика  Казахстан,  г.  Караганды

Е-mail: 

Искакова  Жанар  Бактыбаевна

канд.  хим.  наук ,  ВНС  института  прикладной  химии  ЕНУ  им.  Л.Н.  Гумилева,  Республика  Казахстан,  г.  Астана

Е-mail:   zhanariskakova@mail.ru

Джалмаханбетова  Роза  Илемисовна

д-р  хим.  наук ,  ВНС  института  прикладной  химии  ЕНУ  им.  Л.Н.  Гумилева,  Республика  Казахстан,  г.  Астана

Е-mail: 

">

Cүлеймен  Ерлан  Мэлсұлы

канд.  хим.  наук ,  PhD,  ГНС  института  прикладной  химии,  доцент  кафедры  химии  ЕНУ  им.  Л.Н.  Гумилева,  Республика  Казахстан,  г.  Астана

Е-mail:   syerlan75@yandex.kz

STUDY  OF  BIOLOGICAL  ACTIVITY  AND  ANATOMIC  STRUCTURE  OF  ARTEMISIA  TSCHERNIEVIANA  BESSER  FROM  KAZAKSTAN

Sissengaliyeva  Gulsana  Galymzhankyzy

j unior  Researcher  of  the  Institute  of  Applied  Chemistry  of  ENU,  4th  year  student  of  the  speciality  chemistry  of  L.N.  Gumilev  ENU,  Republic  of  Kazakstan,  Astana

Ishmuratova  Margarita  Yulaevna

candidate  of  Biol.  Sciences,  assistant  Professor  of  Pharmaceutical  Sciences  Karaganda  University  "Bolashak",  Republic  of  Kazakstan,  Karagandy

Iskakova  Zhanar  Baktybaevna

candidate  of  Chem.  Science ,  Leading  Researcher  of  the  Institute  of  Applied  Chemistry  of  ENU,  Republic  of  Kazakstan,  Astana

J almakhanbetova  Roza  Ilemisovna

doctor  of  Chem.  Science,  Leading  Researcher  of  the  Institute  of  Applied  Chemistry  of  ENU,  Republic  of  Kazakstan,  Astana

Suleimen  Yerlan  Melsuly

c andidate  of  Chem.  Science,  PhD,  Chief  Researcher  of  the  Institute  of  Applied  Chemistry  of  ENU,  Associate  Professor  of  Chemistry  Department  of  L.N.  Gumilev  ENU,  Republic  of  Kazakstan,  Astana

Благодарность

Работа  выполнена  по  грантам  МОН  РК  по  бюджетным  программам  055  «Фундаментальные  и  прикладные  научные  исследования»  по  теме  «Фитохимическое  изучение  растений  Казахстана  и  Сибири.  Создание  модифицированных  производных  на  основе  моно-  и  сесквитерпеноидов,  флаваноидов  и  их  биоскрининг»  и  «Создание  образцов  продукции  под  брендом  «Ароматы  степей  Казахстана».

АННОТАЦИЯ

Проведено  изучение  антирадикальной  и  цитотоксической  активности  наработанных  экстрактов  и  эфирного  масла  Artemisia  tschernieviana  Besser,  изучено  анатомическое  строение  растения.

ABSTRACT

The  studies  of  antiradical  and  cytotoxic  activities  of  extracts  and  essential  oil  of  Artemisia  tschernieviana  Besser,  anatomy  structure  of  plant  were  done.

Ключевые  слова:  антирадикальная  активность;  цитотоксическая  активность;  DPPH;  BHA;  анатомическое  строение;  эфирное  масло;  хлороформный  экстракт;  этилацетатный  экстракт;  этанольный  экстракт;  хлороформно-этанольный  экстракт;  Artemisia  tschernieviana  Besser.

Keywords:  antiradical  activity;  cytotoxic  activity;  DPPH;  BHA;  anatomical  structure;  essential  oil;  chloroform  extract;  ethyl  acetate  extract;  ethanol  extract;  chloroform-ethanol  extract;  Artemisia  tschernieviana  Besser.

Artemisia   L.  —  это  род  семейства  Asteraceae  Dumort,  насчитывающий  более  400  видов.  Artemisia  tschernieviana  Besser  (полынь  Черняева)  —  полукустарничек,  50—100  см  высотой;  с  длинными  веточками,  почти  от  основания  ветвящимися.  Листья  черешковые,  в  очертании  продолговато-яйцевидные,  2—6  см  длиной  и  до  3  см  шириной,  гладкие,  дважды  перисто  рассеченные.  Цветочные  корзинки  широко-яйцевидные,  до  4  мм  шириной,  немногочисленные,  сидят  на  коротких  ножках.  Растет  в  пустынной  зоне,  на  песках.  Встречается  в  Прикаспии,  Бузачи,  на  Мангышлаке.  Общее  распространение:  Кавказ.  Эндем  Прикаспийского  региона  [5].

Ранее  была  изучена  антиоксидантная  и  антигемолитическая  активность  полыни  из  Ирана  [9],  с  помощью  метода  гидродистилляции  получено  эфирное  масло,  изучена  его  антимикробная  активность  и  определены  его  основные  компоненты  [8,  12],  получено  эфирное  масло  с  помощью  микроволнового  метода  выделения  “Solvent  free”  и  определены  его  основные  компоненты  [6].

Нами  проведено  изучение  антирадикальной  и  цитотоксической  активности  экстрактов  и  эфирного  масла  A.  tschernieviana,  а  также  проведено  исследование  анатомического  строение  данного  эфиромасличного  сырья.

Надземную  часть  сырья  A.  tschernieviana  (листья  и  стебли)  собирали  в  фазе  бутонизации  на  берегу  Каспийского  моря  22—23  июля  2013  г.  в  Мангыстауской  области,  окр.  г.  Актау),  высушивали  и  измельчали.

Для  изучения  антирадикальной  активности  получили  несколько  экстрактов  A.  tschernieviana  Besser:  хлороформный  (Atsch-1),  этилацетатный  (Atsch-2),  этанольный  (Atsch-3).  Экстракты  получали  следующим  образом:  на  аппарате  Сосклет  измельченную  надземную  часть  A.  tschernieviana  экстрагировали  этилацетатом,  хлороформом,  со  смесью  хлороформа  —  этанола  (соотношение  1:1)  (Atsch-5)  и  этанолом.  Затем  полученные  экстракты  упаривали  на  роторном  испарителе.

Эфирное  масло  (Atsch-4)  получено  методом  гидродистилляции  на  аппарате  Клевенджера.

Метод  исследования.   Для  определения  ингибирования  2,2-дифенил-1-пикрилгидразилрадикала  (DPPH)  к  0,1  мл  спиртового  раствора  исследуемых  растворов  в  диапазоне  концентраций  0,1;  0,25;  0,5;  0,75  и  1,0  мг/мл  добавляли  3  мл  6*10^-5  М  раствора  радикала.  Пробирки  находились  в  штативе,  завернутого  в  черный  полиэтилен.  После  интенсивного  перемешивания  растворы  оставались  в  темноте  на  30  минут,  далее  измеряли  оптические  плотности  при  520  нм.  Значения  величины  антирадикальной  активности  (АРА)  исследуемых  объектов  определяли  по  формуле:

АРА  (%)  =  A₀  –  A_t  /  A₀  *100,

где:  A₀  —  оптическая  плотность  контрольного  образца; 

A_t  —  оптическая  плотность  рабочего  образца.

Оптическую  плотность  исследуемых  растворов  зависимую  от  концентрации  измеряли  на  спектрофотометре  Cary  60  при  длине  волны  520  нм,  оптические  плотности  представлены  в  таблице  1.  Антирадикальную  активность  экстрактов  и  эфирного  масла  мы  сравнивали  с  бутилгидроксианизолом  (BHA)  [11].

Таблица  1.  

Изменение  оптической  плотности  растворов  в  зависимости  от  концентрации

Значения  антирадикальной  активности  экстрактов  и  эфирного  масла,  рассчитанные  по  формуле,  приведены  в  таблице  2.

Таблица  2.  

Антирадикальная  активность  (АРА  %)  веществ  при  разных  концентрациях  рабочих  растворов

На  основании  проведенного  эксперимента  можно  предположить,  что  эфирное  масло  растения  А.  tschernieviana  Besser  (Atsch-4)  проявляет  низкую  антирадикальную  активность  во  всех  концентрациях.  Среди  экстрактов  этого  растения,  АРА  хлороформного  экстракта  (Atsch-1)  составляет  около  30  %,  этилацетатный  экстракт  (Atsch-2)  в  концентрациях  0,25  и  0,5  мг/мл  показал  среднюю  АРА,  но  в  концентрации  1  мг/мл  проявил  низкую  активность.  Антирадикальная  активность  этанольного  экстракта  (Atsch-3)  растения  А.  tschernieviana  Besser  при  концентрации  0,1  мг/мл  была  равна  49,92  %,  а  в  остальных  случаях  показал  высокую  активность  приближенной  АРА  к  веществу  ВНА  (рисунок  1).

Таким  образом,  исследуя  антирадикальную  активность  эфирного  масла  и  экстрактов  Artemisia  tschernieviana  Besser  установлено,  что  наименьшую  АРА  имеет  эфирное  масло,  а  наиболее  высокий  показатель  проявляет  этанольный  экстракт.  Дальнейшее  исследование  экстрактов  в  будущем,  может  привести  к  нахождению  новых  лечебных  свойств  A.  tschernieviana  Besser.

Рисунок  1.  Динамика  антирадикальной  активности  при  изменении  концентрации  веществ

Также  нами  изучена  цитотоксическая  активность  экстрактов  и  эфирного  масла  растения  A.  tschernieviana  Besser.

Метод  определения  цитотоксической  активности  [7,  10].  Делительную  воронку  на  55  мл  заполняли  искусственной  морской  водой  и  добавляли  200  мг  яиц  Artemia  salina.  Выдерживали  в  течение  3-х  дней  при  мягкой  подаче  воздуха  пока  рачки  не  вывелись  из  яиц.  Одну  сторону  трубы  покрывали  алюминиевой  фольгой,  и  5  мин  спустя,  личинок,  которые  собирались  на  яркой  стороне  делительной  воронки,  вынимали  пипеткой  Пастера.

20—40  личинок  помещали  в  990  мл  морской  воды  в  каждой  из  24  микроплошек.  Подсчитывали  мертвых  личинок  под  микроскопом.  Добавляли  по  10  мл  раствора  диметилсульфоксида  на  10  мг/мл  образца.  В  качестве  препарата  сравнения  использовали  актиномицин  Д  или  стауроспорин.  Для  отрицательного  контроля  добавляли  только  10  мл  диметилсульфоксида.  После  24  ч  инкубации  и  дальнейшем  выдерживании  микроплошки  в  течение  24  ч  (для  обеспечения  неподвижности)  посчитывали  мертвые  личинки  под  микроскопом.  Образцы  с  высокой  цитотоксической  эффективностью  (менее  5  %  выживших  личинок)  проверяли  снова  с  концентрациями  50,  10,  5  и  1  мг/мл.

Смертность  P  определяли  по  следующей  формуле:

A  -  N  -  B

P  =  (-------------)  х  100

Z

A=  количество  мертвых  личинок  после  24  ч;  N=  количество  мертвых  личинок  до  проведения  теста;  B=  среднее  количество  мертвых  личинок  в  отрицательном  контроле;  Z=  общее  количество  личинок.

Таблица  3.  

Цитотоксическая  активность  разных  экстрактов  и  эфирного  масла  растения  A.  tschernieviana

Исследование  показало,  что  эфирное  масло  A.  tschernieviana  во  всех  концентрациях  оказывает  острую  летальную  токсичность  —  все  личинки  погибают.  Этилацетатный  экстракт  A.  tschernieviana  в  концентрациях  10  и  5  мг/мл  проявляет  острую  летальную  токсичность  —  все  личинки  погибают,  а  в  концентрации  1  мг/мл  гибель  личинок  составляет  —  24  %.  Хлороформный,  хлороформно-этанольный  (1:1),  этанольный  экстракты  A.  tschernieviana  не  показывают  цитотоксическую  активность.

Анатомическое  исследование  Artemisia  tschernieviana  Besser. 

Для  стандартизации  и  выявления  строения  на  микроуровнях  ценного  растительного  сырья  (уточнения  локализации  эфирного  масла  в  надземных  органах)  A.  tschernieviana,  мы  провели  изучение  его  анатомического  строения.

При  исследовании  сухие  образцы  сырья  A.  tschernieviana  размачивали  в  горячей  воде  и  размягчали  в  смеси  глицерин-спирт-вода  дистиллированная  в  соотношении  1:1:1  [2,  4],  кипятили  в  5  %-ном  водном  растворе  гидроксида  калия.  Изготавливали  поверхностные  препараты  и  срезы  вручную.  Рисунки  выполняли  при  помощи  аппарата  РА-4М.  При  описании  анатомического  строения  использовали  принципы,  изложенные  в  трудах  В.Н.  Вехова,  Л.И.  Лотовой  [1,  3].

Клетки  нижнего  эпидермиса  округлые,  верхнего  эпидермиса  —  прозенхимные,  с  прямыми  стенками  (рис.  2).  Устьица  аномоцитного  типа  (окружены  4  и  более  клетками  эпидермы)  и  встречаются  преимущественно  на  нижней  стороне  листа.  Листья  с  обеих  сторон  негусто  опушены  мелкими  простыми  1-клеточными  трихомами.  Эфиро-масличные  железки  округлой  формы,  сидят  в  углублениях  эпидермиса. 

Рисунок  2.  Препарат  листа  A .  tschernieviana  с  поверхности.  Ув.  15х10:  А  —  нижний  эпидермис,  Б  —  верхний  эпидермис,  1  —  основные  клетки  эпидермы,  2  —  устьица,  3  —  эфиро-масличные  железки,  4  —  простые  трихомы

Листочки  обвертки  цветочной  корзинки  наружные  —  узко-эллиптические,  внутренние  —  широко-эллиптические.  Внутренние  части  травянистые,  зеленые,  наружные  —  пленчатые  (рис.  3).  Поверхность  пронизана  жилками,  в  верхней  части  можно  отметить  эфиро-масличные  железки,  овальной  или  округлой  формы,  приподнимающиеся  над  поверхностью.  Эпидермис  травянистой  части  представлен  мелкими  клетками  изодиаметрической  формы;  пленчатой  части  —  клетками  прозенхимной  формы.

Рисунок  3.  Препарат  листочка  обвертки  A .  tschernieviana  с  поверхности.  Ув.  15х10:  А  —  листочек  обвертки,  Б  —  эпидермис  пленчатой  части,  В  —  эпидермис  травянистой  части,  1  —  эфиро-масличные  железки,  2  —  основные  клетки  эпидермиса

Аналогичное  строение  имеет  и  эпидермис  стебля  A.  tschernieviana  (рис.  4).

Рисунок  4.  Эпидермис  стебля  A .  tschernieviana  с  поверхности.  Ув.  15х10:  1  —  основные  клетки  эпидермы,  2  —  эфиро-масличные  железки

Цветок  обоеполый,  венчик  широко-конический,  эпидермис  в  верхней  части  покрыт  приподнимающимися  эфиро-масличными  железками  (рис.  5).  Эпидермис  состоит  из  мелких,  изодиаметрических  клеток  с  прямыми  стенками. 

Рисунок  5.  Препарат  венчика  цветка  A .  tschernieviana  с  поверхности.  Ув.  15х10:  А  —  обоеполый  цветок,  Б  —  участок  эпидермиса  венчика  цветка,  1  —  основные  клетки  эпидермиса,  2  —  эфиро-масличные  железки

Стебель  на  поперечном  срезе  округло-многогранный  (рис.  6).  Периферическая  часть  покрыта  1-слойным  эпидермисом,  под  ним  в  углах  находятся  участки  механической  ткани  —  уголковой  колленхимы,  остальная  часть  заполнена  многослойной  хлоренхимой.  Проводящую  зону  окружает  кольцо  эндодермы.  Проводящая  система  пучкового  типа.  Пучки  крупные,  размещены  в  форме  кольца;  коллатерального  типа  (флоэма  снаружи,  ксилема  внутри),  открытые  (1-слойный  камбий  между  тяжами  ксилемы  и  флоэмы). 

Рисунок  6.  Схема  поперечного  среза  стебля  A .  tschernieviana.  Ув.  15х10:  1  —  эпидермис,  2  —  колленхима,  3  —  хлоренхима,  4  —  флоэма,  5  —  камбий,  6  —  ксилема,  7  —  эндодерма,  8  —  сердцевинная  паренхима

Таким  образом,  в  качестве  характерных  признаков  надземных  органов  A.  tschernieviana  можно  указать  форма  и  строение  основных  клеток  эпидермиса,  эфиро-масличных  железок  и  простых  кроющих  одноклеточных  трихом. 

Список  литературы:

1.Вехов  В.Н.,  Лотова  Л.И.,  Филин  В.Р.  Практикум  по  анатомии  и  морфологии  высших  растений.  М.:  МГУ,  1980.  —  560  с.

2.Долгова  А.А.,  Ладыгина  Е.Я.  Руководство  к  практическим  занятиям  по  фармакогнозии.  М.:  Медицина,  1977.  —  255  с.

3.Лотова  Л.И.  Ботаника:  Морфология  и  анатомия  высших  растений.  М.:  КомКнига,  2007.  —  512  с

4.Прозина  М.Н.  Ботаническая  микротехника.  М.:  Высшая  школа,  1960.  —  206  с.

5.Флора  Казахстана.  Под  ред.  Павлова  Н.В.,  Алма-Ата,  1960.  —  454  с.

6.Azar  P.A.,  Tehrani  M.S.,  Hosain  S.W.,  Khalilzadeh  M.A.,  Zanousi  M.B.P.  Solvent-Free  Microwave  Extraction  of  Essential  oil  of  Artemisia  tschernieviana  //  Asian  Journal  of  Chemistry.  —  2012.  —  Vol.  24,  —  Issue  11.  —  P.  5388.

7.Durackova  Z.,  Betina  V.,  Hornikova  B.,  Nemec  P.  Zentralbl.  Bakteriol  //  Abt.  II.  —  1977.  —  №  32.  —  P.  294.

8.Kazemi  M.,  Dakhili  M.,  Rustaiyan  A.,  Larijani  K.,  Ahmadi  M.A.,  Mozaffarian  V.  Chemical  Composition  and  Antimicrobial  Activity  of  Artemisia  tschernieviana  Besser  from  Iran  //  Pharmacognosy  Res.  —  2009.  —  №  1.  —  P.  120—124.

9.Naqinezhad  A.,  Nabavi  S.M.,  Nabavi  S.F.,  Ebrahimzadeh  M.A.  Antioxidant  and  antihemolytic  activities  of  flavonoid  rich  fractions  of  Artemisia  tschernieviana  Besser  //  European  Review  for  Medical  and  Pharmacological  Sciences.  —  2012.  —  16(Suppl  3).  —  P.  88—94.

10.Reiss  J.  Zentralbl.  Bakteriol  //  Hyg.  I  Abt.  Orig.  —  1972.  —  №  155.  —  P.  531.

11.Sawant  O.,  Kadam  V.J.,  Ghosh  R.  In  vitro  Free  Radical  Scavenging  and  Antioxidant  Activity  of  Adiantum  lunulatum  //  Journal  of  Herbal  Medicine  and  Toxicology.  —  2009.  —  №  3(2).  —  P.  39—44.

12.Zanousi  M.B.P.,  Azar  P.A.  and  Raeesi  M.  Chemical  composition  and  antimicrobial  activity  of  essential  oils  of  different  organs  of  three  Artemisia  species  from  Iran  //  Journal  of  Medicinal  Plants  Research.  —  2012.  —  Vol.  6(42).  —  P.  5489—5494.