ФОРМИРОВАНИЕ  КОНСОРЦИУМА  УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ  МИКРООРГАНИЗМОВ  ДЛЯ  ОЧИСТКИ  ПОЧВ  ОТ  НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ  В  ПРИРОДНО-КЛИМАТИЧЕСКИХ  УСЛОВИЯХ  ЯКУТИИ

Ерофеевская  Лариса  Анатольевна

научный  сотрудник,  Федеральное  государственное  бюджетное  учреждение  науки  Институт  проблем  нефти  и  газа  Сибирского  отделения  РАН,  РФ,  г.  Якутск

e-mail: 

Глязнецова  Юлия  Станиславовна

канд.  хим.  наук,  старший  научный  сотрудник,  Федеральное  государственное  бюджетное  учреждение  науки  Институт  проблем  нефти  и  газа  Сибирского  отделения  РАН,  РФ,  г.  Якутск

THE  FORMATION  OF  A  CONSORTIUM  OF  ACTIVIZATION  OF  HYDROCARBON  OXIDATIVE  MICROORGANISMS  TO  CLEAN  SOIL  FROM  OIL  SPILLS  IN  THE  CLIMATIC  CONDITIONS  OF  THE  YAKUTIA 

Erofeevskaya  Larisa  Anatoljevna

research  associate  Institute  of  Oil  and  Gas  Problems,  Siberian  Branch  of  the  Russian  Academy  of  Sciences,  Russia  Yakutsk

Gliaznetzova  Yulija  Stanislavovna

candidate.  chem.  sciences,  senior  researcher  Institute  of  Oil  and  Gas  Problems,  Siberian  Branch  of  the  Russian  Academy  of  Sciences,  Russia  Yakutsk

АННОТАЦИЯ

Проведены  лабораторно-полевые  эксперименты  по  изучению  влияния  биопрепаратов  на  основе  природного  сырья  на  очистку  мерзлотной  почвы  от  загрязнений  нефтепродуктами.  По  результатам  изучения  состава  и  химической  структуры  выделенных  экстрактов  почвенных  проб  после  обработки  углеводородокисляющими  бактериями  Bacillus  vallismortis  ВКПМ  В-11017  и  Exiguobacterium  mexicanum  ВКПМ  В-11011  установлена  высокая  степень  деградации  нефтезагрязнения.  За  один  летний  сезон,  на  делянах  с  биопрепаратами,  деструкция  нефти  составила  73,8  %.

ABSTRACT

The  aim  of  these  works  has  been  the  study  of  permafrost  soil  purification  from  oil  products  contamination.  A  high  degree  of  degradation  and  contamination  by  oil  is  established  according  to  the  results  of  studying  the  composition  and  chemical  structure  of  isolated  extracts  of  soil  samples  after  their  treating  with  indigenous  hydrocarbon  oxidizing  bacteria  Bacillus  vallismortis  VKPM  V-11017  and  Exiguobacterium  mexicanum  VKPM  V  -11011.  During  one  summer  season  on  the  plots  with  the  biological  preparations  carriers  the  oil  fuel  destruction  has  made  73,8  %.

Ключевые  слова:  нефть;  бактерии;  экологическая  безопасность;  нефтепродукты;  деградация;  микроорганизмы;  экология;  биопрепараты;  почва;  углеводородное  загрязнение.

Keywords:  oil;  bacteria;  environmental  safety;  оil  products;  degradation;  microorganisms;  ecology;  biological  products;  soil;  hydrocarbonic  pollution.

Одним  из  экологически  обоснованных  и  наиболее  эффективных  методов  восстановления  почв,  загрязненных  нефтью  и  нефтепродуктами,  в  настоящее  время  является  микробиологический  метод,  основанный  на  активации  почвенных  микроорганизмов,  способных  к  утилизации  нефтяных  углеводородов.  Для  мерзлотных  почв  Якутии  выбор  нефтедеструкторов,  эффективно  работающих  в  климатических  условиях  криолитозоны,  требует  специальных  исследований  и  мониторинга  за  процессами  трансформации  и  биологической  деструкции  нефтезагрязнений.

Цель  работы.  Разработать  консорциум  углеводородокисляющих  микроорганизмов  перспективный  для  очистки  нефтезагрязненных  почв  в  природно-климатических  условиях  Якутии. 

Материалы  и  методы  исследований.  В  работе  исследованы  штаммы  Bacillus  vallismortis  ВКПМ  В-11017  и  Exiguobacterium  mexicanum  ВКПМ  В-11011,  депонированные  во  Всероссийской  коллекции  промышленных  микроорганизмов  (ВКПМ)  ФГУП  ГосНИИгенетика,  Москва. 

Для  культивирования  штамма  использовали  метод  жидких  накопительных  культур  на  минеральной  среде  Мюнца  [2,  с.  1024—1030]. 

В  качестве  единственного  источника  углерода  использовали  нефть  Талаканского  месторождения,  с  содержанием  0,82  %  парафиновых  и  12,4  %  смолистых  веществ  [9,  с.  165—170].

Оценку  показателя  жизнеспособности  штамма  проводили  чашечным  методом  Коха  [7,  c.  40]. 

Идентификацию  выделенного  штамма  проводили  на  основе  изучения  их  морфологических,  культуральных  и  физиолого-биохимических  свойств  [3,  c.  830;  4,  с.  800]  с  привлечением  анализа  нуклеотидных  последовательностей  гена  16S  pРНК. 

Построение  деревьев  родства  проводили  с  использованием  технических  возможностей  сайта  [10].

Определение  нефтепродуктов  в  водной  среде  определяли  спектрометрическим  методом,  с  использованием  концентратомера  «ИКН-025»  [8].

Качество  очистки  почв  от  нефтезагрязнений  контролировалось  геохимическими  методами  [1,  с.  1030—1033;  5,  с.  3—9;  6].

Результаты  исследований.

В  результате  целенаправленных  исследований  сформирован  консорциум  УОМ,  перспективный  для  очистки  почв  от  нефтезагрязнений.  Консорциум  представлен  штаммами  Bacillus  vallismortis  ВКПМ  В-11017  и  Exiguobacterium  mexicanum  ВКПМ  В-11011. 

Полученные  штаммы  характеризуются  следующими  признаками:

$11.  Штамм  Bacillus  vallismortis  ВКПМ  В-11017  получен  методом  накопительных  культур  из  пробы  нефтезагрязненной  почвы,  отобранной  на  1351,5  км  участка  трассы  магистрального  нефтепровода  «Восточная  Сибирь-Тихий  Океан».

Культурально-морфологические  признаки.  Грамположительные  споровые  палочки,  в  мазках  расположены  одиночно  и  короткими  цепочками.  На  МПА  формирует  сморщенные  суховатые  колонии  бежевого  оттенка,  диаметром  до  1  см;  через  1—3  суток  колонии  окрашиваются  в  коричневый  цвет,  субстрат  не  пигментируют.  В  МПБ  растет  в  виде  морщинистой  плёнки  бежевого  цвета  поверх  бульона.  На  агаризированной  минеральной  среде  Мюнца  с  нефтью  формирует  непрозрачные  матовые  серо-бежевые  колонии,  диаметром  0,1—0,2  см. 

Физиолого-биохимические  признаки.  Штамм  хорошо  растёт  при  температуре  от  +8  до  +37  °С,  в  аэробных  условиях,  при  рН  6,0—8,0.  Оптимум  роста  +  30  °С.  Способен  к  росту  в  солевом  бульоне  с  добавлением  0,1—2,0  %  NaCl.  Штамм  каталаза  положителен,  оксидаза  отрицателен.  Не  усваивает  лизин  и  орнитин.  Не  потребляет  цитрат  и  малонат  натрия.  Желатин  не  гидролизует.  Крахмал  не  разлагает.  Индол  отрицателен.  Не  образует  сероводород.  Реакция  Фогес-Проскауэра  отрицательная.  Фенилаланиндезоксаминаза  отрицательная.  Ферментирует  бета  галактозидазу. 

При  секвенировании  вариабельных  участков  16S  rDNA  была  получена  следующая  нуклеотидная  последовательность:

TCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGT

GGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTT

GTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCC

GCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACC

TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC

AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA

GGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGG

CACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT

ACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTT

AAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTG

AA

Результаты  обработки  секвенсов  при  помощи  компьютерной  программы  находящейся  на  сайте  RDB  II  (Ribosomal  Database  Project  II),  предназначенной  для  определения  родства  микроорганизмов  и  построения  филогенетических  деревьев,  представлены  в  графическом  виде:

S000003473  0.994  0.942  1423  Bacillus  subtilis  (T);  DSM10;  AJ276351

S000006847  0.994  0.942  1435  Bacillus  mojavensis  (T);  IFO15718;  AB021191

S000012241  0.998  0.998  1440  Bacillus  vallismortis  (T);  DSM11031;  AB021198 

S000014133  0.996  0.986  1426  Bacillus  atrophaeus  (T);  JCM9070;  AB021181

S000428475  0.998  0.964  1337  Bacillus  subtilis  (T);  NRRL  B-23049;  AF074970

S000734915  0.994  0.967  1389  Bacillus  amyloliquefaciens  (T);  NBRC  15535

S000858651  0.988  0.863  1465  Bacillus  licheniformis  (T);ATCC  1458;  DSM  13 

S000858655  0.988  0.863  1466  Bacillus  licheniformis(T);ATCC  14580;  DSM  13 

S000858658  0.988  0.863  1468  Bacillus  licheniformis  (T);  ATCC  14580;  DSM13

Скрининг  по  базе  данных  GenBank  и  RDP-II  показал,  что  исследуемый  штамм  принадлежит  к  следующим  систематическим  группам  Bacteria;  Firmicutes;  Bacilli;  Bacillales;  Bacillaceae;  Bacillus,  гомология  с  видом  Bacillus  vallismortis  составляет  99  %. 

$12.  Штамм  бактерий  Exiguobacterium  mexicanum  ВКПМ  В-11011  получен  методом  накопительных  культур  из  пробы  нефтезагрязненной  почвы,  отобранной  на  4,038  км  шлейфа  участка  трассы  магистрального  нефтепровода  «Восточная  Сибирь-Тихий  Океан».

Культурально-морфологические  признаки.  Грамположительные  палочки,  размером  0,8—1,0  мкм.  В  мазках  располагаются  скоплениями  и  попарно.  Факультативные  анаэробы.  Спор  и  капсул  не  образуют.  На  МПА  формируют  влажные,  от  грязно-желтого  до  оранжевого  цвета  колонии  округлой  формы.  В  МПБ  вызывает  диффузное  помутнение  с  образованием  пленки  поверх  бульона.  На  агаризированной  минеральной  среде  Мюнца  с  нефтью  растет  в  виде  непрозрачных  матовых  колоний,  диаметром  1—3  мм. 

Физиолого-биохимические  признаки.  Штамм  растёт  при  температуре  от  +4  до  +37  °С  при  рН  6,0—8,0,  лучше  в  аэробных  условиях.  Оптимум  роста  +  20+25  °С.  Растёт  в  солевом  бульоне  с  добавлением  0,1—2,0  %  NaCl.  Штамм  каталаза  положителен,  оксидаза  отрицателен.  Не  усваивает  многоатомные  спирты.  Слабо  ферментирует  глюкозу  и  сахарозу.  Не  усваивает  лизин  и  орнитин.  Не  потребляет  цитрат  и  малонат  натрия.  Желатин  не  гидролизует.  Крахмал  не  разлагает.  Индол  отрицателен.  Реакция  Фогес-Проскауэра  отрицательная.  Фенилаланиндезоксаминаза  отрицательная.  Ферментирует  бета  галактозидазу. 

При  секвенировании  вариабельных  участков  16S  rDNA  получена  следующая  собранная  нуклеотидная  последовательность:

GACGGAACCCTTCGGGGGGAAGTCGACGGAATGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAA

AGAACCTGCCCTCAGGTCTGGGATAACCACGAGAAATCGGGGCTAATACCGGATGGGTCA

TCGGACCGCATGGTCCGAGGATGAAAGGCGCTTCGGCGTCGCCTGGGGATGGCTTTGCGG

TGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGATGCATAGCCGACCTGAG

AGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA

GGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGCC

TTCGGGTCGTAAAGTTCTGTTGTAAGGGAAGAACAAGTGCCGCAGGCAATGGCGGCACCT

TGACGGTACCTTGCGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTA

GGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCCTCTTAAGTC

TGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAAGGCNTTGAACGGGAAGCTGAGTATA

Результаты  обработки  секвенсов  при  помощи  компьютерной  программы  (Ribosomal  Database  Project  II)  представлены  в  графическом  виде:

S000417444  0.938  0.711  1403  Exiguobacterium  indicum  (T);  HHS  31;  AJ846291

S000439502  0.940  0.723  1423  Exiguobacterium  oxidotolerans  (T);  AB105164

S000466589  0.975  0.870  1405  Exiguobacterium  profundum  (T);  10C;  AY818050

S000504076  0.977  0.898  1422  Exiguobacterium  aestuarii  (T);  TF-16;  AY594264

S000504078  0.973  0.872  1420  Exiguobacterium  marinum  (T);  TF-80;  AY594266

S000571530  0.990  0.972  1321  Exiguobacterium  mexicanum  (T);  8N;  AM072764

S000650873  0.942  0.716  1458  Exiguobacterium  antarcticum  (T);  DSM  14480

S000650874  0.943  0.725  1458  Exiguobacterium  undae  (T);  DSM  14481;  DQ019165

S000650875  0.990  0.930  1448  Exiguobacterium  aurantiacum  (T);  DSM  6208

S000650876  0.936  0.709  1451  Exiguobacterium  acetylicum  (T);  DSM  20416

Скрининг  по  базе  данных  GenBank  и  RDP-II  показал,  что  исследуемый  штамм  принадлежит  к  следующим  систематическим  группам  Bacteria;  Firmicutes;  Bacilli;  Bacillales;  Bacillaceae;  Exiguobacterium,  гомология  с  видом  Exiguobacterium  mexicanum  составляет  99  %.

Установлено,  что  штаммы  не  проявляют  антагонистической  активности  по  отношению  друг  к  другу,  способны  расти  на  минеральной  среде  Мюнца,  обладают  утилизирующей  способностью  по  отношению  к  нефти,  сохраняют  свою  жизнеспособность  после  зимнего  периода,  что  позволяет  использовать  консорциум  для  очистки  нефтезагрязненных  почв  в  течение  всего  вегетационного  периода.

За  1  северное  лето  деградация  нефти  в  почве  обработанной  суспензиями  на  основе  монокультур  штаммов  Exiguobacterium  mexicanum  ВКПМ  В-11011  и  Bacillus  vallismortis  ВКПМ  В-11017  составила  63,9  и  64,3  %  соответственно,  при  этом  обработка  почвы  смесью  культур  в  соотношении  1:1  способствовала  утилизации  нефтепродуктов  до  73,8  %,  в  то  время,  как  естественные  потери  нефти  в  почве,  не  обработанной  бактериальной  суспензией,  составили  4,1  %  за  тот  же  промежуток  времени  (таблица  1).

Таблица  1. 

Динамика  деструкции  нефтезагрязнения  под  влиянием  штаммов  Bacillus  vallismortis  ВКПМ  В-11017  и  Exiguobacterium  mexicanum  ВКПМ  В-11011

Таким  образом,  разработан  консорциум  штаммов  на  основе  бактерий  Exiguobacterium  mexicanum  ВКПМ  В-11011  и  Bacillus  vallismortis  ВКПМ  В-11017  перспективный  для  очистки  почв  от  нефтезагрязнений  в  природно-климатических  условиях  Якутии.

Вывод.

Применение  консорциума  штаммов  на  основе  бактерий  Exiguobacterium  mexicanum  ВКПМ  В-11011  и  Bacillus  vallismortis  ВКПМ  В-11017  актуально  в  следующих  направлениях:

1. Стимуляция  естественной  углеводородокисляющей  микрофлоры  мерзлотных  почв,  участвующей  в  биодеградации  нефтяных  загрязнений; 
2. Оптимизация  процессов  биологического  окисления  нефти  и  нефтепродуктов  с  целью  достижения  высокого  эффекта  в  очистке  и  доочистке  нефтезагрязненных  мерзлотных  почв;
3. Снижение  токсичности  почв  и  стимулирование  появления  естественного  растительного  покрова  на  загрязненных  участках,  что  значительно  улучшает  санитарно-экологическое  состояние  нарушенных  земель. 

Авторы  выражают  благодарность  сотрудникам  ФГУП  ГосНИИгенетика  за  выполнение  таксономических  исследований.

Список  литературы:

1. Зуева  И.Н.,  Глязнецова  Ю.С.,  Чалая  О.Н,  Лифшиц  С.Х.  Методы  органической  геохимии  при  мониторинге  нефтезагрязнений  и  ремидиации  почв  //  Известия  Самарского  научного  центра  РАН.  —  Том  12(33)  —  №  1  (4),  —  2010.  —  С.  1030—1033.
2. Керстен  Д.К.  Морфологические  и  культуральные  свойства  индикаторных  микроорганизмов  нефтегазовой  съемки  //  Микробиология,  —  1963,  —  №  5,  —  С.  1024—1030.
3. Красильников  Н.А.  Определитель  бактерий  и  актиномицетов,  М.-Л.,  Изд.  АН  СССР,1949.  —  830  с. 
4. Определитель  бактерий  Берджи  /  под  Ред.  Д.  Хоулта,  Н.  Крига,  П.  Снута  и  др.  М.:  Мир,  —  1997,  —  т.  1—2,  —  800  с.
5. Петров  С.И.,  Тюлягина  Т.Н.,  Василенко  П.А.  Определение  нефтепродуктов  в  объектах  окружающей  среды  (обзор)  //  Заводская  лаборатория.  —  1998.  —  №  9.  —  Том  65.  —  С.  3—19.
6. РД  52.18.647-2003.  Методические  указания  определения  массовой  доли  нефтепродуктов  в  почвах.  Методика  измерений  гравиметрическим  методом.
7. Сакович  Г.С.,  Безматерных  М.А.  Физиология  и  количественный  учет  микроорганизмов:  Методические  указания.  Екатеринбург:  ГОУ  ВПО  УГТУ-УПИ,  2005.  —  40  с.
8. ФР.1.31.2007.03234  МВИ  01.02.117  Методика  выполнения  измерений  массовой  концентрации  нефтепродуктов  в  питьевых,  природных  и  сточных  водах  ИК-спектрометрическим  методом  с  использованием  концентратомера  «ИКН-025».
9. Чалая  О.Н.,  Зуева  И.Н.,  Лифшиц  С.Х.,  Трущелева  Г.С.,  Иванова  И.К.  Состав  и  свойства  нефти  Талаканского  месторождения  //Малотоннажная  переработка  нефти  и  газа  в  Республике  Саха  (Якутия):  Материалы  конференции  (26—27  июля  2001  г.,  г.  Якутск).  Якутск,  Изд-во  ЯЧНЦ  СО  РАН,  2001.  —  С.  165—170. 
10. Ribosomal  Database  Project  II.  [Электронный  ресурс]  —  Режим  доступа.  —  URL:  http://rdp.cme.msu.edu  (дата  обращения:  02.09.12)