ПОИСК  И  ПЕРВИЧНАЯ  ОЧИСТКА  БИОЛОГИЧЕСКИ  АКТИВНЫХ  ПОЛИПЕПТИДОВ  ИЗ  АКТИНИИ  URTICINA  CF.  CORIACEA

Кветкина  Александра  Николаевна

студент,  кафедра  биохимии,  микробиологии  и  биотехнологии,  Школа  естественных  наук,  Федеральное  государственное  автономное  образовательное  учреждение  высшего  профессионального  образования  Дальневосточный  Федеральный  Университет,  РФ,  г.  Владивосток

E-mail:  sashaledy.ru@mail.ru

Гладких  Ирина  Николаевна

канд.  хим.  наук,  н.с.  лаборатории  химии  пептидов,  Федеральное  государственное  бюджетное  учреждение  науки  Тихоокеанский  институт  биоорганической  химии  им.  Г.Б.  Елякова  Дальневосточного  отделения  Российской  академии  наук,  РФ,  г.  Владивосток

E-mail:  irinagladkikh@gmail.com

Монастырная  Маргарита  Михайловна

д-р  хим.  наук,  в.н.с.  лаборатории  химии  пептидов,  Федеральное  государственное  бюджетное  учреждение  науки  Тихоокеанский  институт  биоорганической  химии  им.  Г.Б.  Елякова  Дальневосточного  отделения  Российской  академии  наук,  РФ,  г.  Владивосток

E-mail: 

Козловская  Эмма  Павловна

д-р  хим.  наук,  профессор,  Федеральное  государственное  бюджетное  учреждение  науки  Тихоокеанский  институт  биоорганической  химии  им.  Г.Б.  Елякова  Дальневосточного  отделения  Российской  академии  наук,  РФ,  г.  Владивосток

E-mail: 

THE  RESEARCH  AND  PRIMARY  PURIFICATION  OF  BIOLOGICALLY  ACTIVE  POLYPEPTIDES  FROM  ACTINIA  URTICINA  CF.  CORIACEA

Kvetkina  Aleksandra  Nikolayevna

student,  Far  Eastern  Federal  University,  Russia  Vladivostok

Irina  Gladkikh

candidate  of  chemical  sciences,  research  worker  of  the  laboratory  of  Peptide  Chemistry,  G.B.  Elyakov  Pacific  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Far  Eastern  Branch,  Russian  Academy  of  Sciences,  Russia  Vladivostok

Margarita  Monastyrnaya

doctor  of  Chemistry,  leading  research  worker  of  the  laboratory  of  Peptide  Chemistry,  G.B.  Elyakov  Pacific  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Far  Eastern  Branch,  Russian  Academy  of  Sciences,  Russia  Vladivostok

Emma  Kozlovskaya

doctor  of  Chemistry,  professor,  G.B.  Elyakov  Pacific  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Far  Eastern  Branch,  Russian  Academy  of  Sciences,  Russia  Vladivostok

АННОТАЦИЯ

Описано  выделение  и  определение  биологической  активности  полипептидов,  выделенных  из  актинии  Urticina  cf.  coriacea.

ABSTRACT

Process  of  purification  and  determination  of  biologically  active  polypeptides  from  the  sea  anemone  Urticina  cf.  coriacea  is  described.

Ключевые  слова:  актинии;  нейротоксины;  ASIC-каналы

Keywords:  sea  anemones;  neurotoxins;  ASIC-channels

В  последние  годы  проводятся  широкомасштабные  исследования  в  области  химии  и  фармакологии  морских  природных  соединений  (МПС),  направленные  на  разработку  лекарственных  препаратов  нового  поколения.  Интересными  объектами  изучения  являются  морские  кишечнополостные,  актинии,  продуцирующие  огромное  разнообразие  низко-  и  высокомолекулярных  биологически  активных  полипептидов,  таких  как  анемонотоксины  структурных  типов  1  и  2  (5  кДа)  [3,  5—7],  ингибиторы  протеиназ  (6  кДа),  специфически  взаимодействующие  с  различными  биологическими  мишенями  включая  определенные  типы  ионных  каналов  и  ионотропных  рецепторов  [2,  4],  а  также  пороформирующие  токсины  (актинопорины  20  кДа)  [8,  13,  20].  Наиболее  богатыми  источниками  таких  соединений  являются  тропические  виды  актиний.  Так,  из  Heteractis  crispa  (ранее  Radianthus  macrodactylus)  выделен  полипептид  АРНС1,  который,  блокируя  болевой  ваниллоидный  рецептор  TRPV1,  оказывает  выраженное  анальгетическое  действие  in  vivo  на  моделях  тепловой  стимуляции  боли  [11].  Недавно  из  этой  же  актинии  был  выделен  еще  один  полипептид,  π-AnmTX  Hcr  1b-1,  который  блокирует  протончувствительные  Na_V-каналы  электровозбудимых  мембран  (ASIC3  типа)  [9]  и  проявляет  анальгетическую  активность  на  млекопитающих.  Установлено,  что  TRPV1  и  некоторые  типы  ASICs-каналов  играют  важную  роль  в  приеме,  обработке  и  передаче  болевых  стимулов  в  центральную  нервную  систему  [14].

Не  менее  интересным  источником  таких  соединений  являются  актинии  дальневосточных  морей.  Недавно  в  лаборатории  химии  пептидов  ТИБОХ  ДВО  РАН  был  проведен  поиск  биологически  активных  полипептидов  в  ядах  актиний  Охотского  моря,  Urticina  sp.,  Stompia  coccinea,  и  Японского  моря,  Cnidopus  japonicus.  Тестирование  активности  водных  и  этанольных  экстрактов  ядов  методом  тепловой  стимуляции  боли  у  мышей  показало,  что  они  обладают  выраженной  анальгетической  активностью  [1].  В  экстрактах  актиний  северо-западной  части  Тихого  океана  были  найдены  полипептиды,  обладающие  гидролитической  активностью,  а  экстракт  актинии  Metridium  senile  разрушает  хитин  ракообразных  за  счет  содержащегося  в  нем  фермента  хитиназы  [16].  Показано,  что  активность  ферментов  тропических  видов  актиний,  участвующих  в  гидролизе  глюканов,  несколько  ниже,  чем  у  актиний  низкобореальных  вод  Дальнего  Востока  [17].

Для  поиска  и  последующего  выделения  новых  биологически  активных  соединений  белковой  природы  нами  был  выбран  вид  актинии  Охотского  моря  U.  cf.  coriacea,  который  широко  распространен  в  западной  части  Тихого  океана  на  побережье  Северной  Америки,  а  также  около  Курильских  островов.  Канадские  ученые  из  университета  Альберта,  исследовавшие  экстракты  одиннадцати  видов  актиний,  показали,  что  экстракт  актинии  U.  coriacea,  собранной  у  побережья  Канады,  обладает  мощным  цитотоксическим  действием  на  клеточную  линию  HEL  299,  получаемую  из  легочной  ткани  эмбрионов,  а  также  повышает  частоту  сердечных  сокращений  у  крысы  [13].  Это  свидетельствует  о  том,  что  актиния  U.  cf.  coriacea  может  являться  потенциальным  источником  цитотоксинов  и  кардиостимулирующих  соединений. 

Для  получения  яда  из  U.  cf.  coriacea  применили  метод  осмотического  шока  в  сочетании  с  термическим  шоком.  Этот  подход  позволяет  получить  более  чистый  и  концентрированный  яд,  не  загрязненный  белками  и  полипептидами,  содержащимися  в  тканях  тела  животного.  Для  этого  живых  актиний  поместили  в  теплую  дистиллированную  воду  (40—45  °С)  на  15—20  минут  и  периодически  помешивали  их  стеклянной  палочкой  для  дополнительной  стимуляции  выброса  биологически  активных  веществ  из  клеток  щупалец  и  тела.  Полученный  водный  экстракт  после  фильтрования  центрифугировали  и  лиофильно  высушивали.  Для  дальнейшего  разделения  содержащихся  в  нем  биологически  активных  полипептидов  применяли  гидрофобную  хроматографию  на  полихроме-1.  Элюцию  адсорбировавшихся  полипептидов  осуществляли  сначала  водой,  а  затем  последовательно  40  %-ным  и  60  %-ным  этанолом  (рис.  1).  Фракции,  элюированные  водой,  были  проверены  на  содержание  в  них  полипептидов,  обладающих  гемолитической  и  фосфолипазной  активностью.  Результаты  анализа  показали,  что  эти  фракции  обладали  только  гемолитической  активностью.

Полипептиды  40  %-ных  этанольных  фракций  (спирт  предварительно  упаривали)  были  проверены  на  наличие  трипсинингибирующей,  токсической  и  анальгетической  активности.  Было  установлено,  что  трипсинингибирующей  активностью  они  не  обладают,  что  связано,  возможно,  с  примененным  способом  экстракции.  Известно,  что  нейро-,  цитотоксины  и  ингибиторы  протеиназ  были  получены  из  водных  и  этанольных  экстрактов  актиний  путем  гомогенизации  цельного  организма.  Примером  может  служить  актиния  H.  crispa,  из  которой  было  выделено  8  нативных  ингибиторов  протеиназ,  и  для  ингибитора  Jn-IV  была  установлена  полная  аминокислотная  последовательность  [8].  Однако,  согласно  литературным  данным,  в  экстракте  актинии  Gyrostoma  helianthus  ингибиторная  активность  также  не  обнаружена  [19].

Для  определения  токсичности  мышам  вводили  раствор  полипептидов  в  дозе  80,5  мг/кг.  Но  даже  в  такой  дозе  токсичность  полипептиды  не  проявляли.  В  то  же  время  значения  LD₅₀  токсинов,  выделенных  из  тропической  актинии  H.  crispa,  для  мышей  варьировали  от  3000  мкг/кг  до  2,5  мкг/кг  [2—7].

Для  определения  анальгетической  активности  полипептидов,  экстрагированных  40  %-ным  этанолом,  в  экспериментах  in  vivo  использовали  модель  химического  болевого  раздражения,  вызываемого  внутрибрюшинным  введением  1  %-ной  уксусной  кислоты  («кислотная»  модель)  [10].  Показано,  что  при  введении  раствора  полипептидов  в  дозе  590  мкг/мышь  среднее  количество  корчей  у  экспериментальных  животных  составило  25,  а  количество  корчей  у  нелеченных  животных  —  50  (рис.  2).  Это  говорит  о  том,  что  полипептиды  40  %-ных  этанольных  фракций  обладают  анальгетической  активностью.

Рисунок  1.  Гидрофобная  хроматография  полипептидов  водного  экстракта  актинии  U.  cf.  coriacea  на  колонке  с  полихромом-1,  уравновешенным  водой.  Пик  1  —  элюция  полипептидов  дистиллированной  водой,  пик  2  —  40  %-ным  этанолом,  пик  3  —  60  %-ным  этанолом.  Границы  объединенных  полипептидных  фракций,  обладающих  гемолитической  активностью,  отмечены  сплошной  линией,  а  анальгетической  активностью  —  пунктирной.

Согласно  данным  масс-спектрометрического  анализа  (MALDI  TOF  МS)  полипептиды,  присутствующие  во  фракциях  пика  1  (рис.  1),  имели  молекулярные  массы  3822,4;  3981,8;  4132,4;  5232,8;  5379,8;  6024,9;  6952,4;  7609,1  Да  (рис.  3,  А).

Рисунок  2.  Анальгетический  эффект  полипептидов  пика  2  (рис.  1)  на  «кислотной»  модели:  мышам  вводили  100  мкл  раствора  исследуемого  препарата  полипептидов  и  анальгин  внутрибрюшинно.  Через  час  вводили  100  мкл  1  %-ной  уксусной  кислоты  и  подсчитывали  количество  корчей  в  течение  15  мин.  I  —  мыши,  леченные  контрольным  препаратом  сравнения  (анальгин),  II  —  нелеченые  мыши,  III  —  мыши,  леченные  исследуемыми  препаратом  полипептидов.

Во  фракциях  2-го  пика  (рис.  1)  содержались  полипептиды  с  молекулярными  массами:  3039,6;  5376,6;  6948,6;  10559,2  Да  (рис.  3,  Б).  Пептиды  с  молекулярными  массами  в  диапазоне  3822—4132  Да  могут  принадлежать  к  группе  токсичных  APETx2-подобных  пептидов,  обнаруженных  у  актинии  Anthopleura  elegantissima  [12]  и  H.  crispa  [9],  обладающих  анальгетической  активностью,  которая  обусловлена  их  блокирующим  действием  на  ASICs-каналы  (ASIC3  и  ASIC1a),  в  то  время  как  полипептиды  с  молекулярной  массой  около  5000  Да,  очевидно,  принадлежат  к  нейротоксинам  структурных  типов  1  или  2,  модуляторам  Na⁺-каналов  [18].  Наличие  в  масс-спектре  сигналов,  соответствующих  6  кДа,  показывает,  что  во  фракциях  могут  присутствовать  полипептидные  ингибиторы  протеиназ  [2,  4]. 

А                                                         Б

Рисунок  3.  Масс-спектры  полипептидов  в  объединенных  полипептидных  фракциях  пика  1  (А)  и  пика  2  (Б)  (рис.  1)

Полипептиды  со  значениями  молекулярных  масс  около  7  кДа,  возможно,  являются  низкомолекулярными  цитолизинами  (6—7  кДа).  Так,  ранее  из  актинии  низкобореальных  вод  Tealia  felina  был  выделен  низкомолекулярный  полипептид  —  теалиатоксин  с  молекулярной  массой  7,8  кДа  [15],  а  из  водного  экстракта  актинии  R.  macrodactylus  два  цитолизина  RmI  и  RmII  (6  кДа)  [8].

Таким  образом,  установлено,  что  экстракт  актинии  U.  cf.  coriacea  содержит  ряд  биологически  активных  полипептидов,  обладающих  цитолитической  и  анальгетической  активностью.  Полученные  данные  позволяют  предположить,  что  так  же  как  анальгетические  полипептиды  Кунитц-типа  APHC1-APHC3  и  APETx2-подобные  токсины  актинии  H.  Crispa  [9],  биологически  активные  полипептиды  из  U.  cf.  coriacea  могут  обладать  фармакологическим  потенциалом.

Список  литературы:

1.Гладких  И.Н.,  Монастырная  М.М.,  Табакмахер  В.М.,  Кривошапко  О.Н.,  Синцова  О.В.,  Сухова  И.Г.,  Ткачева  Е.С.,  Чаусова  В.Е.,  Костина  Е.Е.,  Попов  А.М.,  Козловская  Э.П.  Поиск  анальгетических  компонентов,  продуцируемых  морскими  актиниями  //  Актуальные  научные  вопросы:  реальность  и  перспективы:  сб.  науч.  тр.  по  материалам  Междунар.  заочной  науч.-практ.  конф.  Тамбов:  Изд-во  ТРОО  «Бизнес-Наука-Общество».  —  2012.  —  Ч.  2.  —  С.  29—33.

2.Зыкова  Т.А.,  Винокуров  Л.М.,  Маркова  Л.Ф.,  Козловская  Э..,  Еляков  Г.Б.  Аминоксилотная  последовательность  трипсинового  ингибитора  IV  из  Radianthus  macrodactylus  //  Биоорган.  химия.  —  1985.  —  T.  11.  —  №  3  —  C.  293—301.

3.Зыкова  Т.А.,  Винокуров  Л.М.,  Козловская  Э.П.,  Еляков  Г.Б.  Аминокислотная  последовательность  нейротоксина  III  из  актинии  Radianthus  macrodactylus  //  Биоорган.  химия.  —  1985а.  —  Т.  11.  —  №  3.  —  С.  302—310.

4.Зыкова  Т.А.,  Винокуров  Л.М.,  Маркова  Л.Ф.  и  др.  Аминокислотная  последовательность  трипсинового  ингибитора  II  из  Radianthus  macrodactylus  //  Биоорган.  химия.  —  1985б.  —  T.  11.  —  №  3.  —  C.  293—301.

5.Зыкова  Т.А.,  Козловская  Э.П.  Аминокислотная  последовательность  нейротоксина  I  из  актинии  Radianthus  macrodactylus  //  Биоорган.  химия.  —  1989а.  —  Т.  15.  —  №  10.  —  С.  1301—1306.

6.Зыкова  Т.А.,  Козловская  Э.П.  Дисульфидные  связи  в  нейротоксине  III  из  актинии  Radianthus  macrodactylus  //  Биоорган.  химия.  —  1989б.  —  Т.  15.  —  №  7.  —  С.  904—907.

7.Зыкова  Т.А.,  Козловская  Э.П.,  Еляков  Г.Б.  Аминокислотная  последовательность  нейротоксинов  IV  и  V  из  актинии  Radianthus  macrodactylus  //  Биоорган.  химия.  —  1988.  —  Т.  14.  —  №  11.  —  С.  1489—1494.

8.Зыкова  Т.А.,  Монастырная  М.М.,  Апаликова  О.В.,  Щвец  Т.В.,  Козловская  Э.П.  Низкомолекулярные  цитолизины  и  ингибиторы  трипсина  из  актинии  Radianthus  macrodactylus.  Выделение  и  частичная  характеристика.  //  Биоорган.  химия.  —  1997.  —  Т.  24.  —  С.  509—516.

9.Козлов  С.А.,  Андреев  Я.А.,  Кошелев  С.Г.,  Иванова  Е.А.,  Лейченко  Е.В.,  Козловская  Э.П.,  Гришин  Е.В.  Патент  на  изобретение  «Полипептид  актинии,  обладающий  анальгетическим  действием»,  РФ  №  2368621.  2009.

10.Козловская  Э.П.,  Монастырная  М.М.,  Гладких  И.М.,  Табакмахер  В.М.,  Кривошапко  О.Н.,  Козлов  С.А.,  Осмаков  Д.И.,  Андреев  Я.А.,  Кошелев  С.Г.,  Гришин  Е.В.  Полипептид  из  морской  анемоны  Heteractis  crispa,  обладающий  анальгетическим  действием.  Патент  РФ  2012108499.  2012.

11.Andreev  Y.A.,  Kozlov  S.A.,  Koshelev  S.G.,  Ivanova  E.A.,  Monastyrnaya  M.M.,  Kozlovskaya  E.P.,  Grishin  E.V.  Analgesic  compound  from  sea  anemone  Heteractis  crispa  is  the  first  polypeptide  inhibitor  of  vanilloid  receptor  1  (TRPV1)  //  J.  Biol.  Chem.  —  2008.  —  Vol.  283.  —  P.  23914—23921.

12.Chagot  B.,  Escoubas  P.,  Diochot  S.,  Bernard  C.,  Lazdunski  M.,  Darbon  H.  Solution  structure  of  APETx2,  a  specific  peptide  inhibitor  of  ASIC3  proton-gated  channels  //  Protein  Sci.  —  2008  —  Vol.  14.  —  P.  2003—2010.

13.Cline  E.I.,  Wolowyk  M.W.  Cardiac  stimulatory,  cytotoxic  and  cytolytic  activity  of  extracts  of  sea  anemones  //  International  Journal  of  Pharmacognosy.  —  1997.  —  Vol.  35  —  №  2  —  P.  91—98.

14.Deval  E.,  Gasull  X.,  Noel  J.,  Salinas  M.,  Baron  A.,  Diochot  S.,  Lingueglia  E.  Acid-sensing  ion  channels  (ASICs):  pharmacology  and  implication  in  pain  //  Pharmacol.  Ther.  —  2010.  —  V.  128.  —  P.  549—558.

15.Elliott  R.C.,  Konya  R.S.,  Vickneshwara  K.  The  isolation  of  a  toxin  from  the  Dahlia  sea  anemone  Tealia  feline  //  Toxicon.  —  1986.  —  Vol.  24.  —  P.  117—122.

16.Elyakova  L.A.,  Distribution  of  cellulase  and  chitinases  in  marine  invertebrates  //  Comp.  Biochem.  Physiol.  B.  —  1972.  —  Vol.  43.  —  P.  67—70.

17.Elyakova  L.A.,  Shevchenko  N.M.,  Avaeva  S.M.  A  Comparative  Study  of  Carbohydrase  Activities  in  Marine  Invertebrates  //  Comp.  Biochem.  Physiol.  B.  —  1981.  —  Vol.  69.  —  P.  905—908.

18.Honma  T.,  Shiomi  K.  Peptide  toxins  in  sea  anemones:  structural  and  functional  aspects  //  Mar.  Biotechnol.  —  2006.  —  Vol.  8.  —  P.  1—10.

19.Mebs  D.,  Liebrich  M.,  Beul  A.,  Samejima  Y.  Hemolisins  and  proteinase  inhibitors  from  sea  anemones  of  Gulf  of  Aqaba  //  Toxicon.  —  1983.  —  Vol.  21  —  №  2  —  P.  257—264.

20.Monastyrnaya  M.M.,  Zykova  T.A.,  Apalikova  O.V.,  Shwets  T.V.,  Kozlovskaya  E.P.  Biologically  active  polypeptides  from  the  tropical  sea  anemone  Radianthus  macrodactylus  //  Toxicon.  —  2002.  —  Vol.  40  —  P.  1197—1217.