ОПРЕДЕЛЕНИЕ  ОБЪЕМА  ГЕМОЦИТОВHARPALUSDENEUSИ  CALATHUSFUSCIPES  С  УЧЕТОМ  ОСОБЕННОСТЕЙ  МИКРОРЕЛЬЕФА  ИХ  ПОВЕРХНОСТИ

Гребцова  Елена  Александровна

аспирант  НИУ  БелГУ,  РФ,  г.  Белгород

E-mail: 

DEFENING  THE  VOLUME  OF  HEMOCYTES  OF  HARPALUS  DENEUS  AND  CALATHUS  FUSCIPES  CONSIDERING  THEIR  MICRORELIEF

Grebtsova  Elena

graduate  student  of  Belgorod  State  University,  Russia  Belgorod

АННОТАЦИЯ

Благодаря  методу  атомно-силовой  микроскопииопределены  точные  значения  объемных  показателей  гемоцитов  Harpalus  deneus  и  Calathus  fuscipes  с  учетом  особенностей  их  микрорельефа.  Проведен  анализ  амплитудных  и  функциональных  параметров  шероховатости  поверхности  в  соответствии  с  международными  стандартами.

ABSTRACT

Using  the  method  of  atomic-force  microscopy  we  defined  exact  volume  value  of  hemocytes  of  Harpalus  deneus  and  Calathus  fuscipes  considering  their  microrelief.  Also  we  analyzed  amplitude  and  functional  parameters  of  the  surface  roughness  according  to  the  ISO.

Ключевые  слова:  объем  клеток;  шероховатость  поверхности  гемоцитов.

Keywords:  cell  volume;  surface  roughness  of  hemocytes.

При  изучении  клеток  исследователи  в  первую  очередь  обращают  внимание  на  их  морфометрические  показатели.  Для  определения  объема  клеток  обычно  используется  формула  для  измерения  объема  эллипсоида  вращения:  ,  где  a,b  и  с  —  полуоси  эллипсоида  (½  длины,  ширины  и  высоты  клетки)  [1,  с.  51;  2,  с.  208;  5,  с.  93].  При  данном  методе  невозможно  учесть  особенности  микрорельефа  поверхности.  Полученные  данные  могут  оказаться  меньше  —  при  наличии  на  поверхности  клеток  выступов,  или  больше  истинных  —  в  случае  преобладания  впадин  [3,  с.  107].

Шероховатость  поверхности,  т.  е.  совокупность  неровностей,  образующих  микрорельеф  поверхности  с  относительно  малыми  шагами,  является  причиной  того,  что  истинная  площадь  поверхности  выше,  чем  геометрическая.  Количественная  оценка  шероховатости  поверхности  мембран  имеет  важное  практическое  значение,  так  как  позволяет  выявить  влияние  гомогенности  или  гетерогенности  поверхности  на  процессы  захвата  инородных  объектов  и  устойчивость  к  гипоосмотическим  нагрузкам  [4,  с.  153;  7,  с.  559]. 

Учитывая  параметры  шероховатости,  метод  атомно-силовой  микроскопии  позволил  точнее  определить  объем  форменных  элементов  гемолимфы.

Цель  данной  работы  —  изучение  возможности  применения  атомно-силовой  микроскопии  (АСМ)  как  метода  определения  параметров  шероховатости  поверхности  гемоцитов  в  соответствии  с  международными  стандартами.

Материалы  и  методы.  В  исследовании  были  использованы  представители  двух  видов  семейства  Carabidae:  Harpalus  deneus  и  Calathus  fuscipes.  Гемолимфу  получали  из  разреза  кончика  антенн.  Каплю  гемолимфы  помещали  на  стекло  и  делали  мазки. 

Исследования  проведеныс  использованием  сканирующего  зондового  микроскопа  Интегра  Вита  NT-MDT  в  режиме  атомно-силовой  спектроскопии  при  наложении  нагрузки  в  25  локальных  участках  клеточной  поверхности.  Обработку  полученных  АСМ-изображений  осуществляли  с  помощью  программного  обеспечения  Imageanalysis  3.5. 

Был  проведен  анализ  следующих  амплитудных  среднестатистических  параметров  шероховатости  поверхности  в  соответствии  с  международными  стандартами  (таблица  1):  средняя  квадратическая  шероховатость  Sq  (nm);  высота  самого  высокого  пика  Sp  (nm);  глубина  самой  глубокой  впадины  Sv  (nm);  асимметрия  Ssk  характеризует  скошенность  распределения  профиля,  когда  один  спад  крутой,  а  другой  —  пологий;  эксцесс  Sku  характеризует  протяженность  распределения  профиля.

Так  же  были  определены  значения  одного  из  функциональных  параметров,  характеризующих  рельеф  в  локальной  области  и  степень  гладкости  поверхности  —  плотность  вершин  (пиков)  Sds  (1/μm²).  Данный  показатель  демонстрирует  количество  вершин  на  единицу  площади,  составляющих  поверхность.

Результаты.  Предварительно  была  проведена  классификация  гемоцитов  с  учетом  их  морфофункциональных  особенностей  [6,  с.  116].  В  гемолимфе  исследуемых  видов  различают  2  постоянных  типа  форменных  элементов:  округлые  гранулоциты,  играющие  основную  роль  в  процессе  фагоцитоза  (рис.  1)  и  веретеновидные  клетки  (рис.  2).

Рисунок  1.  Гранулоцит

Рисунок  2.  Веретеновидный  гемоцит

У  большей  части  гемоцитов  скошенность  распределения  профиля  (Ssk)  не  превышает  0,5  и  не  опускается  ниже  –0,5,  что  говорит  о  приблизительно  равном  соотношении  впадин  и  выступов  плазматической  мембраны.  Величина  эксцесса  (Sku)  находится  в  пределах  от  0  до  3,  следовательно,  на  поверхности  клеток  отсутствуют  экстремальные  пики  и  впадины.Увеличение  значений  этого  параметра  до  4  и  больше  может  быть  связано  с  явлением  распластывания  гемоцитов  по  подложке,  началом  выхода  гранул  из  цитоплазмы  и  «проваливанием»  ядра,  что  создает  дополнительные  перепады.

Таблица  1.

Параметры  микрорельефа  поверхности  гемоцитов  Harpalus  deneus  и  Calathus  fuscipes

Величина  выступов  мембраны  на  поверхности  обоих  типов  форменных  элементов  гемолимфы  варьирует  в  пределах  350—550  nm,  в  то  время  как  глубина  впадин  обычно  не  превышает  200  nm.  Наличие  выступов  мембраны  указывает  на  то,  что  истинная  площадь  ее  поверхности  значительно  превышает  геометрическую.  Данные  выступы  формируют  мембранный  резерв  гемоцитов.  Как  видно  из  таблиц  1  и  2,  на  1  μm²  приходится  в  среднем  1  выступ.  Минимальное  число  неровностей  демонстрирует  поверхность  веретеновидных  гемоцитов  H.  deneus,  однако  характеризующихся  большей  амплитудой  выступов.

Анализ  сканов,  полученных  с  помощью  АСМ,  позволил  определить  объем  фагоцитов  с  учетом  их  микрорельефа.  Реальный  объем  гемоцитов  оказался  примерно  в  1,2—1,5  раза  меньше  показателя,  рассчитанного  с  применением  формулы  определения  объема  эллипсоида  вращения  (таблица  2,  3).

Таблица  2.

Сравнение  объемного  показателя  гранулоцитов,  рассчитанного  через  линейные  параметры  клеток  (V  1)  и  с  помощью  метода  АСМ  (V  2)

Таблица  3.

Сравнение  объемного  показателя  веретеновидных  гемоцитов,  рассчитанного  через  линейные  параметры  клеток  (V  1)  и  с  помощью  метода  АСМ  (V  2)

Выводы: 

Благодаря  использованию  метода  АСМ  были  определены  параметры,  характеризующие  микрорельеф  поверхности  гемоцитов  Harpalus  deneus  и  Calathus  fuscipes.  Мембрана  форменных  элементов  гемолимфы  имеет  многочисленные  выступы  и  впадины.  Минимальное  число  неровностей  на  единицу  площади  характерно  для  веретеновидных  гемоцитов  H.  deneus  и  варьирует  в  пределах  0,4-1.  Анализ  АСМ-изображений  с  учетом  полученных  данных  позволил  точнее  определить  объем  гемоцитов.

Список  литературы:

1.Гребцова  Е.А.,  Присный  А.А.  Определение  мембранного  резерва  гемоцитов  Periplaneta  americana  и  Blaberus  craniifer  и  изучение  влияния  гипоосмотической  нагрузки  на  объем  клеток  //  «Научные  достижения  биологии,  химии,  физики»:  материалы  международной  заочной  научно-практической  конференции.  Новосибирск:  Изд.  «Сибирская  ассоциация  консультантов».  2012.  —  114  с.

2.Присный  А.А.,  Пигалева  Т.А.,  Кулько  С.В.  Морфофункциональные  особенности  гемоцитов  сухопутных  брюхоногих  моллюсков  /  Фундаментальные  исследования.  —  2011.  —  №  5.  —  С.  206—210.

3.Присный  А.А.  Фагоцитарная  активность  гемоцитов  аннелид  как  один  из  путей  достижения  постоянства  внутренней  среды  /  В  мире  научных  открытий.  —  2012.  —  №  2  (26).  —  С.  106—109.

4.Присный  А.А.,  Пигалева  Т.А.  Типология  и  функциональные  особенности  клеточных  элементов  внутренней  среды  обыкновенного  земляного  червя  (Lumbricus  terrestris  L.)  /  Научные  ведомости  Белгородского  государственного  университета.  Серия  Естественные  науки.  —  2012.  —  №  3  (122).  Выпуск  18.  —  С.  151—154.

5.Присный  А.А.,  Кулько  С.В.  Морфофункциональные  особенности  гемоцитов  брюхоногого  моллюска  Stenomphaliaravergieri  (Ferussac)  /  Научные  ведомости  Белгородского  государственного  университета.  Серия  Естественные  науки.  —  2012.  —  №  9  (128).  Выпуск  19.  —  С.  90—94.

6.Присный  А.А.,  Гребцова  Е.А.  Морфофункциональные  особенности  иммунных  клеток  некоторых  представителей  отряда  Coleoptera  /  Научные  ведомости  Белгородского  государственного  университета.  Серия  Естественные  науки.  —  2012.  —  №  15  (134).  Выпуск  20.  —  С.  115—118.

7.Трасатти  С.  Измерения  истинной  площади  поверхности  в  электрохимии  /  С.  Трасатти,  О.А.  Петрий  //  Электрохимия.  —  1993.  —  Т.  29,  —  №  4.  —  С.  557—575.