ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ  МОДЕЛЬ  ФАГОВОЙ  ТЕРАПИИ  В  КИШЕЧНИКЕ  МЫШИ

Зимин  Андрей  Антонович

канд.  биол.  наук,  старший  научный  сотрудник  лаборатории  молекулярной  микробиологии,  Институт  биохимии  и  физиологии  микроорганизмов  им.  Г.К.  Скрябина  РАН,  г.  Пущино

E-mail: 

Васильева  Елена  Леонидовна

стажер  лаборатории  молекулярной  микробиологии,  Институт  биохимии  и  физиологии  микроорганизмов  им.  Г.К.  Скрябина  РАН,  г.  Пущино

Панченко  Наталья  Александровна

стажер  лаборатории  биологических  испытаний,  Филиал  Института  биоорганической  химии  им.  М.М.  Шемякина  и  Ю.А.  Овчинникова  РАН,  г.  Пущино

Дьяченко  Игорь  Александрович

канд.  биол.  наук,  научный  сотрудник  лаборатории  биологических  испытаний,  Филиал  Института  биоорганической  химии  им.  М.М.  Шемякина  и  Ю.А.  Овчинникова  РАН,  г.  Пущино

Мурашев  Аркадий  Николаевич

д-р  биол.  наук,  заведующий  лабораторией  биологических  испытаний,  Филиал  Института  биоорганической  химии  им.  М.М.  Шемякина  и  Ю.А.  Овчинникова  РАН,  г.  Пущино

PHAGE  THERAPY  EXPERIMENTAL  MODEL  IN  THE  MOUSE  INTESTINE

Andrei  Zimin

ph.D.,  senior  researcher  of  the  Laboratory  of  Molecular  Microbiology,  G.K.  Skryabin  Institute  of  Biochemistry  and  Physiology  of  Microorganisms,  Russian  Academy  of  Sciences,  Pushchino

Elena  Vasilyeva

trainee  of  the  Laboratory  of  Molecular  Microbiology,  G,K.  Skryabin  Institute  of  Biochemistry  and  Physiology  of  Microorganisms,  Russian  Academy  of  Sciences,  Pushchino

Natalia  Panchenko

trainee  of  the  Laboratory  of  Biological  tests,  the  Branch  of  the  M.M.  Shemyakin  and  Yu.  A.  Ovchinnikov  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Pushchino

Igor  Dyachenko

Ph.D.,  researcher  of  the  Laboratory  of  Biological  tests,  the  Branch  of  the  M.M.  Shemyakin  and  Yu.A.  Ovchinnikov  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Russian  Academy  of  Sciences,  Pushchino

Arkady  Murashev

Doctor  of  Biological  Sciences,  head  of  the  Laboratory  of  Biological  tests,  the  Branch  of  the  M.M.  Shemyakin  and  Yu  A  Ovchinnikov  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Russian  Academy  of  Sciences,  Pushchino

АННОТАЦИЯ

Целью  нашей  работы  было  создание  эффективной  модели  фаговой  терапии  в  кишечнике  мыши.  Основным  методом  работы  был  подбор  генетически  маркированных  штаммов  E.coli  способных  размножаться  в  кишечнике  лабораторного  животного.  В  качестве  такого  кандидата  экспериментально  был  отобран  штамм  E.coli  CR204,  так  как  он  обладал  наибольшей  длительностью  сохранения  в  толстой  кишке  мыши  с  наиболее  высоким  тиром  и  наличием  маркера  устойчивости  к  антибиотику  —  канамицину,  хромосомной  локализации.  Таким  образом,  была  создана  экспирементальная  модель  для  исследований  в  области  фаговой  терапии  в  кишечнике  лабораторного  животного. 

ABSTRACT

The  aim  of  our  study  was  to  create  an  effective  model  of  phage  therapy  in  the  mouse  intestine  .  The  main  method  of  work  was  the  selection  of  genetically  marked  strains  of  E.coli  are  able  to  multiply  in  the  intestines  of  laboratory  animals.  As  such  a  candidate  has  been  selected  experimentally  strain  E.coli  CR204,  as  it  had  the  longest  duration  stored  in  mouse  colon  highest  shooting  range  and  the  presence  of  an  antibiotic  resistance  marker  —  kanamycin  chromosomal  localization.  Thus  ,  there  was  an  experimental  model  for  studies  of  phage  therapy  laboratory  animal  intestine  .

Ключевые  слова:  экспериментальная  модель  фаговой  терапии,  штаммы  E.coli,  лабораторные  животные.

Keywords:  experimental  model  of  phage  therapy,  the  strains  of  E.coli,  laboratory  animals.

Работа  была  частично  поддержана  грантом  РФФИ  №  13-04-00991.

Введение.  Существенным  препятствием  к  широкому  применению  фаговых  препаратов  является  недостаток  знаний  об  отношениях  фаг-хозяйская  клетка,  особенно  в  организме  животного.  Одним  из  наиболее  распространенных  типов  таких  взаимоотношений  может  быть  трансдукция  элементов  генома  бактерии  бактериофагом.  В  связи  с  тем,  что  такой  процесс  может  существенно  повлиять  на  свойства  симбиотической  микробной  популяции,  необходимо  его  тщательное  исследование.  Изучение  системы  —  фаг-бактерия-организм  —  возможно  только  в  экспериментальной  модели  с  использованием  лабораторных  животных.  Поэтому  целью  нашей  работы  стало  создание  эффективной  модели  в  кишечнике  мыши.

Результаты.  Для  создания  экспериментальной  модели  для  исследования  трансдукции  в  кишечнике  животного  в  данной  работе  были  взяты  лабораторные  штаммы,  отличающиеся  по  физиологическим  и  генетическим  характеристикам.  Это  штаммы  E.coli  С600  с  плазмидой  pBR322,  несущей  ген  устойчивости  к  ампициллину,  E.coli  В  с  плазмидой  pBR322,  CR204,  имеющий  хромосомный  ген  канамицинустойчивости  в  составе  транспозона.  В  экспериментах  использовали  белых  лабораторных  мышей  массой  33—35  г. 

Лабораторные  штаммы  E.coli  обладают  сниженной  жизнеспособностью  в  природных  условиях.  Поэтому  на  начальном  этапе  работы  была  проведена  проверка  жизнеспособности  выбранных  штаммов  в  кишечнике  экспериментального  (подопытного)  животного.  Для  этого  вводили  мышам  клетки  в  количестве  2,5*10⁸  клеток/мл.  Отбирали  пробы  через  15  мин,  1  час,  3  часа,  7  часов,  1  сутки,  7  суток.  В  каждый  эксперимент  было  взято  по  три  животных.  Для  выполнения  работы  в  условиях  in  vivo  была  предложена  специальная  методика  исследования  выживаемости  бактерий  в  кишечнике.  Ночную  культуру  клеток  исследуемого  штамма  разводили  1:20  в  5  мл  среды  LB  и  подращивали  до  оптической  плотности  0,17  при  длине  волны  560нм,  что  соответствует  количеству  2,5*10⁸  клеток/мл.  150  мкл  такой  культуры  вводили  зондом  в  желудок  мышей  (на  голодный  желудок).  Для  отбора  проб  гипернаркотизировали  животное  хлороформом  в  эксикаторе,  вскрывали  брюшную  полость  и  вырезали  по  2см  кишечника  на  участках,  соответствующих  12-типерстной  кишке,  тонкому  и  толстому  кишечнику  (для  12-типерстной  —  первые  2  см,  для  тонкого  и  толстого  —  2  см  в  средней  части).  Пробы  измельчали  и  помещали  в  пробирки  с  3  мл  среды  LB  без  антибиотика,  перемешивали.  Через  1—2  мин  перемешивание  повторяли.  При  необходимости  делали  разведения  проб  и  высевали  0,1  мл  полученной  суспензии  на  чашки  с  твердой  агаризованной  средой,  содержащей  селективный  антибиотик  и  выращивали  колонии  при  37  °С.  В  экспериментах  со  штаммом  E.coli  CR204  клетки  высевали  на  шашки  с  богатой  средой,  содержащей  канамицин  —  50  мкг/мл,  а  со  штаммом  E.coli  С600  с  плазмидой  pBR322  на  среду,  содержащую  ампицилин  —  100  мкг/мл.  Через  15  минут  после  введения  бактерий  жизнеспособные  клетки  обнаруживались  только  в  двенадцатиперстной  кишке  (от  15  до  27  колоний),  через  1  час  только  в  тонком  кишечнике  (30—53  колонии).  Через  три  часа  бактерии  достигали  толстого  кишечника  (121—2676  колоний)  и  далее  начинали  колонизировать  этот  отдел  желудочно-кишечного  тракта  мыши  (1542—6005  колоний).  Через  7  часов  титр  клеток,  введенного  штамма  либо  достигал  максимума  в  случае  с  о  штаммом  E.coli  CR204  (1542—1850  колоний),  либо  начинал  немного  снижаться  для  другого  штамма  E.coli  В  с  плазмидой  pBR322  (784—850).  Через  сутки  жизнеспособные  бактерии  были  обнаружены  только  в  одном  опыте  со  штаммом  E.coli  CR204  —  17  колоний. 

Таким  образом  было  показано,  что  клетки  ни  одного  из  штаммов  не  колонизируют  кишечник  и  элиминируются  примерно  через  сутки  после  введения.  Этот  факт  можно  объяснить  существованием  резидентной  микрофлоры  и  связанной  с  ней  колонизационной  резистентностью  желудочно-кишечного  тракта  животного.  Полученный  нами  результат  подтверждается  и  данными  из  литературных  источников,  где  описаны  подобные  эксперименты  с  другими  лабораторными  штаммами  E.coli  (1,2). 

Для  продолжения  исследования  был  выбран  штамм  E.coli  CR204,  так  как  он  обладал  наибольшей  длительностью  сохранения  в  толстой  кишке  мыши  с  наиболее  высоким  тиром  и  наличием  маркера  устойчивости  к  антибиотику  —  канамицину,  хромосомной  локализации.  Он  оставался  в  кишечнике  по  истечении  7  часов  в  титре  примерно  1,5*10³  клеток  на  пробу.  Штамм  E.coli  B  с  плазмидой  pBR322  также  можно  было  использовать  для  подобных  опытов  (количество  по  истечении  7  часов  —  около  0,5  10³клеток  на  пробу).

Таким  образом,  была  сконструирована  модельная  система  фаговой  терапии  в  кишечнике  мыши.

Список  литературы:

1.Chibani-Chennoufi  S.,  Sidoti  J.,  Bruttin  A.,  Kutter  E.,  Sarker  S.,  Brussow  H.  (2004).  In  vitro  and  in  vivo  bacteriolytic  activities  of  Escherichia  coli  phages:  implications  for  phage  therapy.  AntimicrobAgents  Chemother,  —  2004.  —  №  48,  —  pp.  2558—2569.

2.Smith  H.W.,  Huggins  M.B.  &  Shaw  K.M.  (1987).  Factors  influencing  the  survival  and  multiplication  of  bacteriophages  in  calves  and  in  their  environment.  J  Gen  Microbiol,  —  1987.  —  №  133,  —  pp.  1127—1135.