APETX2-ПОДОБНЫЕ  ТОКСИНЫ  АКТИНИИ  HETERACTIS  CRISPA

Калина  Римма  Сергеевна

студент,  Федеральное  государственное  автономное  образовательное  учреждение  высшего  профессионального  образования  Дальневосточный  Федеральный  Университет,  г.  Владивосток

E-mail:  kalinarimma@gmail.com

Гладких  Ирина  Николаевна

канд.  хим.  наук,  науч.  сотр.  лаборатории  химии  пептидов,  Федеральное  государственное  бюджетное  учреждение  науки  Тихоокеанский  институт  биоорганической  химии  им.  Г.Б.  Елякова  Дальневосточного  отделения  Российской  академии  наук,  г.  Владивосток

Кошелев  Сергей  Геннадьевич

канд.  биол.  наук,  с.н.с.  лаборатории  нейрорецепторов  и  нейрорегуляторов,  Федеральное  государственное  бюджетное  учреждение  науки  Институт  биоорганической  химии  имени  академиков  М.М.  Шемякина  и  Ю.А.  Овчинникова  Российской  академии  наук,  г.  Москва

Монастырная  Маргарита  Михайловна

д-р  хим.  наук,  в.н.с.  лаборатории  химии  пептидов,  Федеральное  государственное  бюджетное  учреждение  науки  Тихоокеанский  институт  биоорганической  химии  им.  Г.Б.  Елякова  Дальневосточного  отделения  Российской  академии  наук,  г.  Владивосток

Козловская  Эмма  Павловна

д-р  хим.  наук,  профессор,  Федеральное  государственное  бюджетное  учреждение  науки  Тихоокеанский  институт  биоорганической  химии  им.  Г.Б.  Елякова  Дальневосточного  отделения  Российской  академии  наук,  г.  Владивосток

APETX2-LIKE  TOXINS  FROM  ACTINIA  HETERACTIS  CRISPA

Kalina  Rimma

student,  Far  Eastern  Federal  University,  Vladivostok

Gladkikh  Irina

candidate  of  chemical  sciences,  research  worker  of  the  laboratory  of  Peptide  Chemistry,  G.B.  Elyakov  Pacific  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Far  Eastern  Branch,  Russian  Academy  of  Sciences,  Vladivostok

Koshelev  Sergej

candidate  of  biological  sciences,  senior  research  worker  of  the  laboratory  of

neuroreceptors  and  neuroregulators,  M.M.  Shemyakin  and  Yu.A.  Ovchinikov  Institute  of  Bioorganic  Chemistry  of  the  Russian  Academy  of  Sciences,  Moscow

Monastyrnaya  Margarita

doctor  of  Chemistry,  leading  research  worker  of  the  laboratory  of  Peptide  Chemistry,  G.B.  Elyakov  Pacific  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Far  Eastern  Branch,  Russian  Academy  of  Sciences,  Vladivostok

Kozlovskaya  Emma

doctor  of  Chemistry,  professor,  G.B.  Elyakov  Pacific  Institute  of  Bioorganic  Chemistry,  Far  Eastern  Branch,  Russian  Academy  of  Sciences,  Vladivostok

АННОТАЦИЯ

Описано  выделение  и  определение  биологической  активности  APETx2-подобных  токсинов  из  актинии  Heteractis  crispa  —  модуляторов  ASICs  каналов.

ABSTRACT

Process  of  purification  and  determination  of  biological  activity  of  the  APETx2-like  toxins  from  the  sea  anemone  Heteractis  crispa,  channel  modulators  of  ASICs,  is  described. 

Ключевые  слова:  актинии;  APETx2;  ASICs.

Key  words:  sea  anemones;  APETx2;  ASICs.

Работа  поддержана  грантом  Президиума  РАН  №  12-I-P6-10  «Молекулярная  и  клеточная  биология»  и  грантом  ДВО  РАН  №  13-III-В-05-075  «Новые  токсины  ASICs-каналов  из  актинии  Heteractis  crispa".

Среди  морских  организмов,  продуцирующих  биологически  активные  соединения,  особое  место  занимают  морские  кишечнополостные,  актинии.  Их  яды  содержат  широкий  спектр  белковых  компонентов,  в  том  числе  нейротоксины-модуляторы  ионных  каналов  и  ионотропных  рецепторов  (Na⁺,  K⁺,  Са²⁺,  ASICs  и  др.),  участвующих  в  формировании  болевого  сигнала  и  его  передаче  в  ЦНС  [9].  Направленное  действие  на  различные  биологические  мишени  и  огромное  структурное  разнообразие  нейротоксинов  позволяют  использовать  их  для  создания  высокоспецифичных  обезболивающих  препаратов,  а  также  в  качестве  инструментов  изучения  строения  и  механизмов  функционирования  ионных  каналов.

К  настоящему  времени  обнаружено  лишь  два  полипептидных  токсина  актиний,  ингибирующих  кислоточувствительные  ASICs  каналы:  APETx2  (4557,96  Да),  продуцируемый  актинией  Anthopleura  elegantissima,  который  обратимо  ингибирует  ASIC3,  ASIC2b+3,  ASIC1a+3  и  ASIC1b+3  каналы  крысы  [6],  и  π-AnmTX  Hcr  1b-1  (4537  Да),  полученный  нами  из  H.  crispa,  ингибирующий  ASIC3  каналы  человека  [3].

Недавно  из  70  %-ного  этанольного  экстракта  H.  crispa  с  помощью  гидрофобной  хроматографии  на  полихроме-1  и  последующей  ОФ-ВЭЖХ  получено  одиннадцать  фракций  полипептидов  (рис.  1,  А,  Б),  значения  молекулярных  масс  которых,  по  данным  MALDI-TOF  MS,  варьировали  от  4500  до  5000  Да  (рис.  1,  В-И).  Тестирование  полипептидных  фракций  5,  7,  9  и  10  in  vivo  на  модели  кислотной  стимуляции  боли  показало,  что  они  проявляют  анальгетическую  активность  [1].  При  электрофизиологическом  исследовании  на  ASICs  каналах,  экспрессированных  в  мембранах  ооцитов  лягушки  Xenopus  laevis,  было  обнаружено,  что  наибольшей  ингибирующей  активностью  обладают  полипептиды  9-ой  фракции:  они  блокируют  ASIC3  каналы  человека  на  74  %,  а  ASIC1а  каналы  крысы  —  на  57  %  (рис.  2).  Очевидно,  токсины,  содержащиеся  во  фракциях  5—10,  являются  представителями  мультигенного  семейства,  о  чем  свидетельствует  их  большое  количество  и  близость  молекулярных  масс  (рис.  1,  В-И).  Это  затрудняет  получение  полипептидов  в  индивидуальном  состоянии  и  требует  применения  методов  молекулярной  биологии.  Ранее  наличие  мультигенных  семейств  было  обнаружено  нами  для  пороформирующих  токсинов  и  ингибиторов  протеиназ  семейства  Кунитца,  продуцируемых  актинией  H.  Crispa  [2,  5].

Согласно  множественному  выравниванию  полипептиды,  выделенные  из  H.  сrispa,  можно  отнести  к  группе  АРЕТх2-подобных  токсинов  (рис.  3),  среди  которых  детально  охарактеризованы  АРЕТх1,  АРЕТх2  и  АРЕТх3  из  A.  elegantissima,  специфично  ингибирующие  калиевый  канал  HERG,  ASIC3  и  Na_V1.2—Na_V1.8  каналы  соответственно  [4,  6,  7],  π-AnmTX  Hcr  1b-1  из  H.  crispa,  ингибирующий  ASIC3  [3],  а  также  токсины  BDS-I  и  BDS-II  из  Anemonia  viridis  [11],  блокирующие  каналы  подтипов  K_V3.1,  3.2,  3.4;  мишени  остальных  токсинов  [8,  10]  пока  не  известны. 

Следует  отметить  высокую  степень  гомологии  аминокислотных  последовательностей  АРЕТх1  и  АРЕТх2  (73,8  %)  и  более  низкую  с  π-AnmTX  Hcr  1b-1  (50  %).  Тем  не  менее,  это  позволит  использовать  их  для  установления  структур  АРЕТх2-подобных  токсинов  методами  молекулярной  биологии.

Рисунок  1.  Профиль  элюции  полипептидов,  содержащихся  в  70  %-ном  этанольном  экстракте  H.  crispa,  полученный  (А)  в  результате  гидрофобной  хроматографии  на  полихроме-1;  (Б)  ОФ-ВЭЖХ  полипептидной  фракции  пика  4  (рис.  1,  А)  на  колонке  Nucleosil  C₁₈.  Отмечены  границы  объединения  активных  фракций.  (В-И)  Масс-спектры  полипептидов  (рис.  1,  Б),  содержащихся  во  фракциях  5  (В),  6  (Г),  7  (Д),  8  (Е),  9  (Ж),  10  (З),  11  (И)

Рисунок  2.  Записи  токов  через  ASIC3  каналы  человека  (А)  и  ASIC1а  каналы  крысы  (Б),  экспрессированные  в  ооцитах  лягушки  X.  laevis.  Токи  индуцированы  полипептидной  фракцией  9  (рис.  1,  Б)  и  изменением  значения  рН  буферного  раствора  от  7,8  до  4,0.  Клетки  фиксированы  при  потенциале  —50  мВ,  скорость  потока  раствора  ~1  мл/мин

Рисунок  3.  Множественное  выравнивание  аминокислотных  последовательностей  APETx1–APET3,  U-AITX-Ael1a  из  A.  Elegantissima  [4,  6,  7,    10],  BDS-I  и  BDS-II  из  A.  Viridis  [11],  π-AnmTX  Hcr  1b-1  из  H.  Crispa  [3],  Bcg  III  из  Bunodosoma  сangicum  [8],  Bc  IV,  V  из  B.  Сaissarum  [8]  и  U-AITX-Bg1a,  b,  c,  d,  e  из  B.  Granulifera  [10].  Выравнивание  выполнено  с  помощью  программы  CLUSTALW.  Идентичные  и  консервативные  участки  отмечены  темным  и  светлым  оттенками  серого  цвета  соответственно.  Звездочками  обозначены  высоко  консервативные  а.о.,  cверху  показана  схема  расположения  дисульфидных  мостиков

Список  литературы:

1. Калина  Р.С.,  Поиск  новых  токсинов  ASIC3-каналов  из  актинии  Heteractis  crispa  //  XIV  Всероссийская  молодежная  школа-конференция  по  актуальным  проблемам  химии  и  биологии:  Тез.  докл.  Владивосток:  ТИБОХ  ДВО  РАН.  —  2012.  —  С.  18.
2. Новые  актинопорины  актинии  Heteractis  crispa:  клонирование  и  функциональная  экспрессия  /  Е.С.  Ткачева  и  др.  //  Биохимия.  —  2011.  —  Т.  76.  №  10.  —  С.  1387—1397.
3. Полипептидный  токсин  из  морской  анемоны,  ингибирующий  протон-чувствительный  канал  ASIC3  /  С.А.  Козлов  и  др.  //  Биоорган.  химия.  —  2012  —  Т.  38.  №  6.  —  С.  653—659.
4. A  natural  point  mutation  changes  both  target  selectivity  and  mechanism  of  action  of  sea  anemone  toxins  /  S.  Peigneur  et  all.  //  FASEB  J.  —  2012.  Vol.  26.  №  12.  —  P.  5141—5151.
5. A  new  multigene  superfamily  of  Kunitz-type  protease  inhibitors  from  sea  anemone  Heteractis  crispa  /  M.P.  Isaeva  et  all.  //  Peptides.  —  2012.  —  V.  34.  №  1.  —  Р.  88—97.
6. A  new  sea  anemone  peptide,  APETx2,  inhibits  ASIC3,  a  major  acid-sensitive  channel  in  sensory  neurons  /  S.  Diochot  et  all.  //  EMBO  J.  —  2004.  —  Vol.  23.  —  P.  1516—1525.
7. APETx1,  a  new  toxin  from  the  sea  anemone  Anthopleura  elegantissima,  blocks  voltage-gated  human  ether-a-go-go-related  gene  potassium  channels  /  S.  Diochot  et  all.  //  Mol.  Pharmacol.  —  2003.  —  V.  64  —  P.  59—69.
8. BcIV,  a  new  paralyzing  peptide  obtained  from  the  venom  of  the  sea  anemone  Bunodosoma  caissarum.  A  comparison  with  the  Na⁺-channel  toxin  BcIII  /  J.S.  Oliveira  et  all.  //  Biochim.  Biophys.  Acta.  —  2006.  —  V.  1764.  —  P.  1592—1600.
9. Honma  T.  Peptide  toxins  in  sea  anemones:  structural  and  functional  aspects  /  T.  Honma,  K.  Shijmi  //  Mar.  Biotechnol.  —  2005.  —  Vol  8.  №  1.  —  P.  1—10.
10. Peptide  fingerprinting  of  the  neurotoxic  fractions  isolated  from  the  secretions  of  sea  anemones  Stichodactyla  helianthus  and  Bunodosoma  granulifera.  New  members  of  the  APETx-like  family  identified  by  a  454  pyrosequencing  approach  /  A.A.  Rodríguez  et  all.  //  Peptides.  —  2012.  —  Vol.  34.  —  P.  26—38.
11. Sea  anemone  peptides  with  a  specific  blocking  activity  against  the  fast  inactivating  potassium  channel  K_V3.4  /  S.  Diochot  et  all.  //  J.  Biol.  Chem.  —  1998.  —  Vol.  273.  —  P.  6744—6749.