КИНЕТИЧЕСКИЕ  МОДЕЛИ  ДЛЯ  ТЕСТИРОВАНИЯ  АНТИОКСИДАНТОВ

Перевозкина  Маргарита  Геннадьевна

канд.  хим.  наук,  старший  преподаватель  Государственного  аграрного  университета  Северного  Зауралья,  г.  Тюмень

E-mail: 

KINETIC  MODELS  FOR  TESTING  OF  ANTIOXIDANTS

Margarita  G.  Perevozkina

candidate  of  Science,  Senior  Lecturer,  Department  of  State  Agrarian  University  of  North  Zauralye,  Tyumen

АННОТАЦИЯ

Разработана  кинетическая  модель  экспресс-тестирования  антиоксидантной  активности  (АОА)  различных  классов  органических  соединений  в  условиях,  приближенных  к  условиям  биологической  среды.  Показано,  что  скорость  окисления  модельных  липидов  в  водно-эмульсионной  среде  в  1000  раз  выше,  чем  в  безводной  среде.  Исследована  АОА  важнейших  органических  ингибиторов  в  сравнении  со  стандартными  антиоксидантами  дибунолом  и  a-токоферолом  в  водно-липидных  катализируемых  субстратах.  Установлены  константы  скорости  реакции  k₇  с  пероксильными  радикалами  для  наиболее  активных  АО. 

ABSTRACT

Developed  kinetic  model  lipid  rapid  testing  antioxidant  activity  (AOA)  of  various  classes  of  organic  compounds.  The  rate  of  oxidation  of  lipids  in  model  water-emulsion  medium  is  1000  times  higher  than  in  non-aqueous  medium.  Investigated  AOA  important  organic  inhibitors  compared  with  standard  antioxidants  dibunol  and  α-tocopherol  the  water-catalyzed  lipid  substrates.  Set  the  rate  constant  of  k₇  with  peroxyl  radicals  for  the  most  active  AO.  The  participation  of  effective  inhibitors  of  oxidation  in  the  process  of  destruction  by  molecular  hydroperoxides.

Ключевые  слова:  каталитическое  окисление  липидов,  экспресс-тестирование  антиоксидантной  активности,  пероксидное  окисление,  соли  металлов  переменной  валентности,  мицеллы,  водно-эмульсионная  среда.

Keywords:  catalytic  oxidation  of  lipids,  rapid  testing  antioxidant  activity,  lipid  oxidation,  salts  of  metals  of  variable  valency,  micelles,  water-emulsion  environment.

В  связи  с  широким  внедрением  ингибиторов  окисления,  актуальной  остается  проблема  предварительного  тестирования  их  антиоксидантной  активности.  Поскольку  большинство  известных  моделей  для  тестирования  антиоксидантов  являются  гидрофобными,  представлялось  актуальным  подобрать  гидрофильную  липидную  систему  и  проверить  её  эффективность  на  примере  известных  химических  соединений,  предположительно  имеющих  антиоксидантную  активность,  сравнить  их  действие  с  реперными  ингибиторами  окисления. 

Известно,  что  катионы  металлов  входят  в  структуру  биокластеров,  активных  центров  многочисленных  белков-ферментов.  Так,  железо  входит  в  состав  гемоглобина,  цитохромов,  каталазы,  содержится  в  ферритине,  трансферрине.  Кобальт  входит  в  состав  цианокобаламина  (витамина  В₁₂),  его  аналоги  являются  кофакторами  различных  ферментов,  участвующих  в  эритропоэзе.  Медь  содержится  в  цитохроме-С-оксидазе,  в  голубых  белках,  супероксиддисмутазе  [2].

Особенности  окисления  липидов  в  клетке  обусловлены,  прежде  всего,  каталитической  активностью  катионов  металлов  и  возможностью  участия  ферментов  в  регулировании  этих  процессов.  Известны  многочисленные  работы  по  тестированию  активности  катионов  металлов,  которые  относятся,  в  основном,  к  катализу  гомогенных  липидных  систем  [1,  13—19].  Эти  результаты  имеют  ограниченное  значение  для  описания  процессов  окисления,  протекающих  в  мицеллах  и  живой  клетке.  Мало  работ,  в  которых  сравниваются  антиоксидантные  свойства  соединений  различных  классов  в  безводной  и  водно-эмульсионной  (ВЭС)  средах  в  условиях  инициирования  и  катализа. 

Целью  данного  исследования  являлась  разработка  кинетического  способа  тестирования  антиоксидантной  активности  различных  классов  органических  соединений  (фенолов,  аминов,  серосодержащих  соединений),  в  условиях,  приближенных  к  биологическим  средам,  изучение  антиоксидантной  активности  ряда  полифункциональных  соединений  в  сравнении  с  реперными  антиоксидантами  дибунолом  и  a-токоферолом. 

Экспериментальная  часть

Антиоксидантную  активность  (АОА)  изучали  манометрическим  методом  поглощения  кислорода  в  модифицированной  установке  типа  Варбурга  при  окислении  модельного  субстрата  (метиллинолеата  (МЛ),  метилолеата  (МО)  и  этилолеата  (ЭО))  в  присутствии  триметилцетиламмоний  бромида  (ЦТМАБ)  в  качестве  поверхностно-активного  вещества  (ПАВ)  (10^-4—10^-2  М),  с  добавками  растворов  солей  металлов  в  количестве  (10^-6—10^-1  М)  при  t=(60±0,2)⁰С.  Соотношение  воды  и  эфира  составляло  3:1,  а  общий  объем  пробы  4  мл  [10].  Кинетику  поглощения  кислорода  в  безводной  среде  изучали  в  среде  инертного  растворителя  хлорбензола,  процесс  инициировали  за  счет  термического  разложения  АИБН.  Использовали  термостатируемую  окислительную  ячейку  объёмом  2—5  см³,  окисление  проводили  кислородом  воздуха,  температура  опытов  составляла  (60±0,2)⁰С.  Графическим  методом  определяли  величину  периода  индукции  (t_i),  представляющей  собой  отрезок  оси  абсцисс,  отсекаемый  перпендикуляром,  опущенным  из  точки  пересечения  касательных,  проведенных  к  кинетической  кривой.  Эффективность  торможения  процесса  окисления  липидного  субстрата  определяется  совокупностью  реакций  ингибитора  и  обозначает  его  антиоксидантную  активность,  количественно  определяемой  по  формуле  АОА=  t_i–t_S  /t_S,  где  t_S  и  t_i  —  периоды  индукции  окисления  субстрата  в  отсутствие  и  в  присутствии  исследуемого  АО  соответственно,  сравнивали  с  действием  ингибитора,  принятого  за  стандарт,  используя  отношение  t_i  /  t_реп,,  где  t_реп.  —  период  индукции  реперного  ингибитора.  Скорость  инициирования  определяли  уравнением  Wi  =  f  [InH]  /  t_i,  где  f  —  стехиометрический  коэффициент  ингибирования,  [InH]  —  концентрация  ингибитора,  t_i  —  период  индукции.

Антирадикальную  активность  (АРА)  тестировали  в  системе  инициированного  окисления  этилбензола  хемилюминесцентным  (ХЛ)  методом  совместно  с  к.х.н.  И.Ф.  Русиной  [9].  Кинетику  накопления  гидропероксидов  изучали  при  аутоокислении  модельных  субстратов  (МО  и  линолевой  кислоты  (ЛК))  методом  обратного  йодометрического  титрования  в  среде  хлорбензола,  t=60°С  [6].  В  качестве  реперных  ингибиторов  использовали  a-токоферол  (a-ТФ)  и  дибунол,  при  этом  концентрации  АО  были  сравнимыми.  Критическую  концентрацию  мицеллообразования  ЦТМАБ  изучали  методом  Ребиндера  и  рефрактометрическим  методом.

Результаты  и  их  обсуждение

Разработка  кинетического  метода  базировалась  на  исследовании  активности  солей  металлов  переменной  валентности:  сульфата  железа  (II),  хлорида  железа  (III),  хлорида  никеля  (II),  хлорида  кобальта  (II),  хлорида  меди  (II)  в  водно-липидных  субстратах.  Для  эмульгирования  модельного  субстрата  использовали  поверхностно-активное  соединение  ЦТМАБ,  в  качестве  липидов  исследованы:  метилолеат,  этилолеат,  метиллинолеат,  линолевая  кислота.  С  целью  выбора  наиболее  эффективного  катализатора  изучали  в  сравнительном  аспекте  влияние  упомянутых  выше  солей  на  процесс  окисления  МЛ.  Более  детальное  изучение  кинетики  окисления  липидных  субстратов  в  присутствии  металлов  переменной  валентности  было  показано  раннее  в  работе  [10].

На  рисунке  1  представлены  кинетические  кривые  (КК)  поглощения  кислорода  в  присутствии  равных  добавок  (1´10^-3  М)  солей  железа  (II,III),  никеля  (II),  кобальта  (II)  и  меди  (II).  Из  рис.  1  видно,  что  в  сравнимых  концентрациях  наиболее  эффективным  катализатором  является  хлорид  меди  (II).  Для  него  отмечается  наибольшая  скорость  процесса,  оцениваемая  из  наклона  кинетических  кривых  (КК).  При  сопоставлении  абсолютных  значений  максимальной  скорости  окисления  (W_мах)  исследуемые  катализаторы  располагаются  в  следующем  порядке:  NiCl2  <  FeCl3  <  Fe2SO4  <  CoCl2  <  CuCl2. 

Рисунок  1.  Кинетика  окисления  МЛ  в  водно-эмульсионной  среде  в  присутствии  добавок  солей  металлов  в  концентрации  1×10^-3  М  :  1  —  CuCl₂,  2  —  FeSO₄,  3  —  CoCl₂,  4  —  FeCl₃,  5  —  NiCl₂,  1×10^-3  М  С_ЦТМАБ,  t=60°  С

В  результате  исследований  установлено,  что  аутоускоренный  характер  имеет  кинетика  окисления  водно-липидных  субстратов  только  в  присутствии  катионов  Fe²⁺,  Co²⁺  и  Cu²⁺.  Характер  кинетических  кривых  окисления  липидных  субстратов  в  зависимости  от  концентрации  катионов  позволил  предполагать  преобладающее  участие  Fe³⁺  ,  Ni²⁺  в  обрыве  цепей,  участие  Fe²⁺,  Co²⁺,  Cu²⁺  в  зарождении  и  разветвлении  цепей. 

Рисунок  2.  Зависимость  стационарных  скоростей  окисления  МЛ  в  присутствии  солей  катализаторов  от  их  концентрации,  М:1  —  NiCl2,  2  —  FeCl3,  3  —  Fe2SO4,  4  —  CoCl2,  5  —  CuCl2,  1×10^-3  М  С_ЦТМАБ,  t=60°  С

Действие  упомянутых  выше  солей  было  изучено  в  широком  диапазоне  концентраций  для  отбора  среди  них  наиболее  эффективных  катализаторов.  На  рисунке  2  приведены  закономерности  изменения  максимальной  скорости  процесса  окисления  от  концентрации  катализатора.  Можно  видеть,  что  концентрационные  зависимости  для  всех  веществ  носят  экстремальный  характер,  экстремумы  проявляются  в  разных  диапазонах.

Скорости  окисления  липидных  субстратов  в  присутствии  солей  NiCl2  и  FeCl3  выходят  на  максимум  при  концентрациях  1,0×10^-3  М,  далее  с  ростом  концентрации  их  значение  не  меняется  и  составляет  (4,0±0,2)×10^-5  М×с^-1  и  (5,0±0,3)×10^-5М×с^-1  соответственно.  Максимальная  скорость  при  окислении  с  добавками  сульфата  железа  отмечается  в  диапазоне  (0,1—1,0)  М  и  составляет  (9,4±0,4)×10^-5  М×с^-1,  при  дальнейшем  росте  концентрации  —  остается  постоянной  и  составляет  (6,0±0,2)×10^-5  М×с^-1.  Зависимость  W_max  систем  с  добавками  хлорида  кобальта  имеет  ″пик″  при  концентрации  (9—11)×10^-3  М,  при  которой  ее  величина  составляет  (24,4±0,4)×10^-5  М×с^-1.  Хлорид  меди  по  своим  каталитическим  свойствам  выделяется  среди  всех  исследуемых  веществ.  Скорость  окисления  в  присутствии  хлорида  меди  выше  в  5  раз,  чем  в  присутствии  других  солей  металлов  переменной  валентности  и  при  концентрации  2×10^-3  М  составляет  (26,3±0,3)×10^-5  М×с^-1  (табл.1). 

Таблица  1.

Кинетические  параметры  окисления  метиллинолеата  в  присутствии  солей  железа  (II,III),  никеля  (II),  кобальта  (II)  и  меди  (II)  в  ВЭС,  t=  60⁰С,  С  _ЦТМАБ  =  1´10^-3  М,  вода:липиды  -  3:1.

В  нашем  эксперименте  каталитическая  активность  солей  металлов  уменьшается  в  ряду:  Cu²⁺  >  Fe²⁺  >  Fe  ³⁺  >  Co²⁺>  Ni²⁺.  Ранее  каталитическое  действие  металлов  переменной  валентности  изучалось  при  окислении  растительных  масел  и  модельных  липидных  субстратов  [13,  14,  2,  16,  17—19].  Был  получен  ряд  каталитической  активности  катионов  :  Cu²⁺  >  Mn²⁺  >  Fe²⁺  >  Cr²⁺  >  Ni²⁺  >>  Zn²⁺.  Как  видно  из  приведенных  выше  данных  изученные  соли  вписываются  в  указанный  ряд  активности  металлов,  а  хлорид  меди  обладает  наибольшей  каталитической  активностью  при  наименьшей  концентрации  2´10^-3  М. 

Следующим  этапом  создания  модели  для  тестирования  антиоксидантов  был  выбор  концентрации  ЦТМАБ.  Известно  [4,  5],  что  скорость  окисления  в  гомогенных  системах  ниже,  чем  в  эмульсиях  и  зависит  от  степени  ее  дисперсности.  В  работе  [2]  установлено,  что  соотношение  констант  скорости  роста  и  обрыва  цепи  при  инициированном  окисление  кумола  в  эмульсиях  и  гомогенной  системе  соотносится  как  5,5:1  и  равно  110  и  20  соответственно. 

Нами  также  было  установлено,  что  скорость  окисления  МЛ  в  водно-эмульсионной  среде  ~  в  1000  раз  выше,  чем  в  безводной  среде.

При  выборе  оптимальной  концентрации  ЦТМАБ  исследовали  диапазон  (10^-4—10^-2)  М.  Установлено,  что  с  ростом  концентраций  ПАВ  скорость  процесса  проходит  через  максимум,  соответствующий  концентрации  1  ×  10^-3  М.  Дальнейшее  повышение  концентрации  ЦТМАБ  приводит  к  снижению  скорости  окисления.  Указанную  концентрацию  детергента,  обеспечивающую  наибольшую  скорость  реакции,  можно  рекомендовать  для  использования  в  гетерогенных  моделях  окисления.  Методом  Ребиндера  и  рефрактометрическим  методом  была  определена  критическая  концентрация  мицеллообразования  ЦТМАБ  (1,0±0,2)  ×  10^-3  М,  что  соответствовало  кинетическим  данным.

Механизм  каталитического  окисления  липидов  в  водно-эмульсионной  среде  сводится  к  следующему:  в  присутствии  ЦТМАБ  формируются  мицеллы.  Добавки  катионного  ПАВ  усиливают  мицеллообразование,  при  этом  катионы  внедряются  в  промежутки  между  углеводородными  «хвостами»  и  образуют  двойной  электрический  слой.  При  образовании  свободных  радикалов  высших  жирных  кислот  катионы  катализатора  должны  иметь  доступ  к  гидрофобным  хвостам  субстрата.  При  низких  концентрациях  катионы  катализатора  имеют  большую  вероятность  донорно-акцепторного  взаимодействия  с  эфирными  группами  субстрата,  приводящего  к  образованию  в  присутствии  катализатора  свободных  радикалов  по  реакции:

Вероятно,  существуют  оптимальные  концентрации  ЦТМАБ,  при  которых  количество  контактов  катиона  катализатора,  липидов  и  кислорода  максимально.  При  увеличении  концентрации  ЦТМАБ  количество  катионов  на  поверхности  мицеллы  возрастает,  происходит  более  интенсивное  отталкивание  катионов  катализатора,  снижение  скорости  зарождения  цепей  и  скорости  процесса  окисления.

В  соответствии  с  приведенной  гипотезой,  добавки  1×10^-3  М  ЦТМАБ  являются  оптимальными,  обеспечивающими  максимальный  контакт  катионов  меди  и  кислорода  с  жирно-кислотными  радикалами.  Увеличение  концентрации  ПАВ  снижает  количество  таких  контактов,  и  скорость  процесса  соответственно.

Механизм  действия  металлов  связывают  с  каталитическим  разрушением  гидропероксидов  в  соответствии  с  реакциями  [4]:

Образующиеся  при  этом  алкоксильные  и  пероксильные  радикалы  участвуют  в  дальнейшем  в  реакциях  продолжения  цепей  окисления.  Катионы  металлов  могут  конкурентно  участвовать  в  обрыве  цепей,  что  должно  приводить  к  замедлению  процесса  на  глубоких  стадиях  окисления.  Замедление  процесса  возможно  также  за  счет  перехода  катиона  металла  в  менее  активную  форму.

Таким  образом,  результаты  настоящего  исследования  демонстрируют  возможности  новой  кинетической  модели,  которая  может  быть  предложена  для  изучения  процессов  свободно-радикального  окисления  липидных  субстратов  различного  происхождения.

Подобные  закономерности  наблюдаются  и  при  окислении  этилолеата  и  метилолеата.

На  основе  проведенных  исследований  была  предложена  новая  кинетическая  модель  для  тестирования  биоантиоксидантов.  Модельный  субстрат  содержит  2×10^-3  М  хлорида  меди  (II),  1×10^-3  М  ЦТМАБ,  липиды  (МО,  ЭО,  МЛ)  и  воду,  соотношение  липиды-вода  1  :  3.

В  настоящем  работе  приведены  результаты  исследования  кинетики  каталитического  окисления  липидного  субстрата  в  водно-эмульсионной  среде  в  присутствии  ряда  полифункциональных  соединения  в  зависимости  от  концентрации  и  структуры,  без  учета  спектра  их  фармакологического  действия.  Ряд  производных  фенола  составили:  салициловая  кислота,  парацетамол,  осалмид.  Ряд  двухатомных  фенолов  представляли:  пирокатехин,  адреналин,  метилдофа.  В  качестве  гетероциклических  производных  использовались:  фентоламин,  аллопуринол,  эмоксипин.  В  качестве  аминов  исследовали:  новокаин,  коринфар.  В  качестве  серосодержащего  соединения  изучали  капотен.  Реперными  АО  послужили  a-токоферол  и  дибунол.  Химические  формулы  изучаемых  соединений  представлены  в  табл.  2.

Для  доказательства  свободно-радикального  механизма  каталитического  окисления  липидного  субстрата  использован  метод  ингибиторов.  Проведено  исследование  закономерностей  окисления  модельного  субстрата  (МЛ,  ЭО)  в  присутствии  добавок  стационарных  ингибиторов  окисления  дибунола  и  a-токоферола.  По  результатам  эксперимента  рассчитаны  кинетические  параметры  окисления  субстратов. 

В  нашем  исследовании  показан  идентичный  характер  КК  окисления  ЭО  в  растворе  хлорбензола  в  присутствии  6×10^-3  М  инициатора  и  водно-эмульсионной  системе  в  присутствии  2×10^-3  М  хлорида  меди  при  разных  концентрациях  дибунола  (Рис.  3  а.  б).  Показано,  что  в  водно-эмульсионной  среде  дибунол  проявляет  себя  как  сильный  ингибитор:  наблюдается  период  полного  торможения,  период  аутоускорения  и  достижение  максимальной  скорости  окисления.  Периоды  индукции  увеличиваются  пропорционально  увеличению  концентрации  дибунола.  Наличие  торможения  в  присутствии  добавок  дибунола  является  признаком  радикально-цепного  механизма  процесса.  По  наклону  прямой  в  координатах  t,[InH]  была  рассчитана  скорость  инициирования  в  обеих  системах  (Рис.4),  получены  значения  6,2×10^-8  и  6,7×10^-5  М×с^-1  в  безводной  и  водно-эмульсионной  системе  соответственно.  Сравнение  максимальных  скоростей  окисления  ЭО  при  t=(60  ±  0,2)°С  в  безводной  и  водно-эмульсионной  средах  равных  1,3×10^-7  и  1,4×10^-4  М×с^-1  соответствует  различию  скоростей  инициирования  ~  в  1000  раз.

Рисунок  3  а.  Кинетика  окисления  этилолеата  в  безводной  среде  в  присутствии  добавок  дибунола,  М  :  1  —  контроль,  6×10^-3  М  АИБН;  2  —  5×10^-6,  3  —  1×10^-5,  4  —  5×10^-5,  5  —  1×10^-4,  6  —  5×10^-4,  7  —  7,5×10^-4,  8  —  1×10^-3,  t=60°  С

Было  показано,  что  реперный  биоантиоксидант  a-токоферол  в  ВЭС  проявлял  слабые  антиоксидантные  свойства,  в  концентрациях  свыше  1×10^-3  М  промотировал  процесс  окисление  липидных  субстратов  (рис.  5,  табл.  4).  Полученные  результаты  указывают  на  более  сложный  механизм  действия  a-токоферола  в  катализируемом  субстрате.  Причиной  ускорения  процесса  может  быть  комплексообразование  OH-группы  a-токоферола  с  катализатором.  В  процессе  окисления  a-токоферол  образует  достаточно  активные  токофероксильные  радикалы,  способные  участвовать  в  побочных  реакциях  продолжения  цепей  с  молекулами  субстрата  (RH): 

Рисунок  3  б.  Кинетика  окисления  этилолеата  в  водно-эмульсионной  среде  в  присутствии  добавок  дибунола,  моль/дм³  :  1  —  контроль,  2×10^-3  моль/дм³  CuCl₂;  2  —  1×10^-6,  3  —  2×10^-5,  4  —  5×10^-5,  5  —  1×10^-4,  6  —  5×10^-4,  t=60°  С

Поскольку  известно  [3,  8,  11,  12],  что  в  углеводородной  среде  увеличение  АРА  фенолов  происходит  под  влиянием  электронодонорных  заместителей,  рассмотрим  полученные  ряды  соединений  в  зависимости  от  структуры.

В  соответствии  с  теорией,  ингибиторы  условно  делятся  на  сильные  и  слабые.  Сильные  ингибиторы  эффективно  тормозят  окисление,  участвуя  только  в  реакциях  обрыва  цепей.  Кинетика  такого  процесса  характеризуется  периодом  полного  торможения,  аутоускорением  и  достижением  максимальной  скорости.  Слабые  ингибиторы  способны  не  только  обрывать  цепи,  но  из-за  высокой  активности  своих  радикалов,  участвовать  в  реакциях  продолжение  цепей.  Кинетика  такого  процесса  характеризуется  отсутствием  периодом  полного  торможения,  достаточно  высокими  начальными  скоростями,  аутоускорением  на  определенном  уровне  окисления,  достижением  максимальной  скорости.  Алкилированные  в  пара-  и  орто-положения  фенолы,  двухатомные  фенолы  считаются  сильными  нигибиторами.  Каждая  алкильная  или  гидроксильная  группа  увеличивает  АРА  на  определенную  величину.  Ингибитор  тем  эффективнее,  чем  меньше  полярность  и  больше  размер  заместителя  в  пара-  положении.  В  аминах  заместители  электронодоноры  повышают  их  антирадикальную  активность.  В  фенолах  и  аминах  антирадикальная  активность  тем  выше,  чем  ниже  окислительно-восстановительный  потенциал.  Иногда  амины  оказывают  ускоряющее  действие,  сто  связано  с  увеличением  скорости  зарождения  цепей  за  счет  взаимодействия  с  гидропероксидами  по  радикальному  механизму. 

Рисунок  4.  Зависимости  периода  индукции  от  концентрации  дибунола  в  безводной  среде  в  присутствии  6×10^-3  моль/дм³  АИБН  (  1  )  и  в  водно-эмульсионной  среде  в  присутствии  2×10^-3  моль/дм³  CuCl₂  (  2  ),  t=60°  С

Методом  хемилюминесценции  в  группе  исследуемых  соединений  была  оценена  величина  константы  скорости  реакции  k₇  АО  с  пероксильными  радикалами  [9]: 

где:  InH  —  ингибитор  окисления, 

In•  —  радикал  ингибитора, 

RO₂•—  пероксильный  радикал. 

Таблица  2.

Химические  формулы  изучаемых  антиоксидантов

Стехиометрический  фактор  ингибирования  f,  показывающий  количество  свободных  радикалов,  реагирующих  с  молекулой  ингибитора,  приведен  в  табл.  3.  При  исследовании  кинетики  изменения  интенсивности  ХЛ  в  присутствии  исследуемых  соединений  было  установлено,  что  все  АО  оказывают  ингибирующее  действие  на  процесс  окисления  модельного  субстрата.  Показано,  что  наибольшую  активность  в  реакции  с  пероксильными  радикалами  проявляет  осалмид  (табл.  3),  константа  скорости  реакции  k₇  которого  обусловлена  акцепторным  характером  заместителя  в  пара-положении,  наличием  p-р-сопряжения  между  амино-группой  и  фенолом.  АРА  осалмида  может  складываться  из  активности  двух  гидроксильных  групп,  в  парацетамоле  донорный  заместитель  содержится  в  пара-положении.  В  салициловой  кислоте  антирадикальная  активность  может  снижаться  за  счет  акцепторного  характера  карбоксильной  группы.  Сравнение  констант  скорости  реакции  k₇  исследуемых  соединений  и  a-ТФ  показывает,  что  основной  природный  АО  более  активен  в  реакции  с  пероксильными  радикалами  (практически  в  360  раз).  Однако,  описанные  выше  закономерности  изменения  антирадикальной  активности  в  соответствии  с  донорным  или  акцепторным  характером  заместителей  далеко  не  однозначны. 

Исследована  кинетика  окисления  модельного  субстрата  в  ВЭС  с  добавками  фенола.  Показано,  что  все  концентрации  фенола  замедляют  процесс  окисления,  снижая  начальную  и  максимальную  скорости  пропорционально  концентрации  (рис.  5  табл.  4).  Представленные  результаты  свидетельствуют  о  том,  что  в  данной  системе  фенол  является  слабым  ингибитором,  но  продукты  его  превращения  участвуют  в  обрыве  цепей. 

Из  литературы  известно  [12],  что  в  этилбензоле  при  t=60°С  k₇  для  фенола  и  пирокатехина  равны  3×10³  и  6×10⁵  М×с  соответственно.  По  результатам  нашего  исследования  (табл.4)  эффективность  торможения  при  всех  концентрациях  пирокатехина  существенно  ниже,  чем  для  подобных  концентраций  фенола.  Очевидно,  что  причину  такого  различия  нельзя  объяснить  структурой  фенолов  и  следует  связывать  с  влиянием  активности  катализатора.  Пирокатехин  существенно  тормозит  окисление  ЭО  только  при  концентрациях  1×10^-2  М  и  выше.  При  концентрации  пирокатехина  1×10^-4  М  происходит  ускорение,  а  при  его  концентрации  1×10^-3  М  очень  слабое  замедление  процесса  (рис.  6).  Вероятно,  ускорение  процесса  обусловлено  активацией  катализатора  за  счет  комплексообразования  с  солями  меди.  При  концентрации  пирокатехина  1×10^-2  М  его  соотношение  с  катализатором  составляет  5:1.  В  этих  условиях  большая  часть  пирокатехина  не  задействована  в  комплексообразовании  и  проявляет  антиоксидантную  активность.

Таблица  3.

Значения  константы  скорости  реакции  АО  с  пероксильными  радикалами  RO₂°  W_i=2,3×10^-8  М×с^-1;  С_АО=  1´10^-3  М;  t=60°

АОА  салициловой  кислоты  всегда  ниже,  чем  у  фенола  и  уменьшается  с  увеличением  её  концентрации.  Такой  характер  влияния  салициловой  кислоты  может  быть  обусловлен  образованием  салицилата  меди. 

Впервые  АОА  осалмида  была  показана  в  нашей  работе  [7].  Осалмид  проявлял  более  высокую  антиоксидантную  активность,  чем  фенол.  Установлено,  что  все  исследуемые  концентрации  осалмида  уменьшали  начальную  и  максимальную  скорости  окисления  в  5  раз  по  сравнению  с  контролем.  Высокая  эффективность  торможения  осалмида  связана  с  участием  в  реакциях  обрыва  цепей.  Во  всем  диапазоне  изученных  концентраций  парацетамол  снижал  начальную  и  максимальную  скорости  окисления,  по  сравнению  с  контролем  в  2—5  раз,  проявляя  высокую  АОА,  уступая  только  осалмиду  (рис.  5,  табл.  4). 

Рисунок  5.  Кинетика  окисления  этилолеата  в  водно-эмульсионной  среде  в  присутствии  добавок  АО  в  концентрации  1×10^-3  М:  1  —  контроль;  2  —  a-токоферол;  3  —  салициловая  кислота;  4  —  фенол;  5  —  парацетамол;  6  —  осалмид;  2×10^-3  М  CuCl₂,t=60°  С

Таблица  4.

Кинетические  параметры  окисления  липидных  субстратов  в  водно-эмульсионной  среде  в  присутствии  2×10^-3  М  CuCl₂  в  зависимости  от  концентрации  АО,  t=60°С

Исходя  из  концентрационных  зависимостей,  получаем  ряд  уменьшения  АОА  активности:  дибунол  >  осалмид  >  парацетамол  >  фенол  >  салициловая  кислота.

Особый  интерес  представляет  поведение  аминофенолов  при  каталитическом  окислении  липидных  субстратов.  Известно,  что  многие  наиболее  активные  компоненты  клетки  являются  аминами,  около  80  %  лекарственных  препаратов  также  представляют  собой  амины.  В  настоящей  работе  исследованы  аминофенолы  и  амины.

Рисунок  6.  Кинетика  окисления  этилолеата  в  водно-эмульсионной  среде  в  присутствии  добавок  АО  в  концентрации  1×10^-3  М:  1  —  контроль,  2  —  фентоламин;  3  —  пирокатехин;  4  —  новокаин;  5  —  коринфар;  6  —  аллопуринол;  7  —  эмоксипин,  2×10^-3  М  CuCl₂,t=60°  С

Представляет  интерес  сравнение  антиоксидантного  эффекта  пирокатехина  и  его  производных:  адреналина,  метилдофы.  Взаимосвязь  между  периодами  индукции  и  концентрацией  исследуемых  соединений  во  всем  изученном  диапазоне  положительная  (рис.  6.  Табл.  4).  При  всех  концентрациях  соединения  более  активны,  чем  пирокатехин.  Очевидно,  что  в  производных  пирокатехина  орто-гидроксильные  группы  связаны  комплексообразованием  с  солями  меди.  Поэтому,  высокая  антиоксидантная  активность  адреналина  и  метилдофы  свидетельствует  об  эффекте  за  счет  аминогруппы.  Снижение  максимальной  скорости  окисления  может  свидетельствовать  об  участии  аминов  в  реакциях  с  гидропероксидами  с  образованием  молекулярных  продуктов. 

Рисунок  7.  Кинетика  окисления  метиллинолеата  в  водно-эмульсионной  среде  в  присутствии  капотена:  1  —  контроль;  2  —  1×10^-6  М;  3  —  1×10^-4  М;  4  —  1×10^-3  М;  5  —  1×10^-2  М;  6  —  1×10^-1  М,  2×10^-3  М  CuCl₂,t=60°  С

Рассмотрим  ряд  гетероциклических  производных:  фентоламин,  аллопуринол,  эмоксипин.  Фентоламин  относится  к  амино-фенолам  первой  группы,  в  присутствии  которых  при  различных  концентрациях  происходит  окисление  мицеллярного  субстрата  без  периода  индукции  и  периода  аутоускорения.  Низкая  АОА  фентоламина  может  быть  обусловлена  нарушением  сопряжения  из-за  объемного  заместителя  в  положении  3.  В  эмоксипине  в  положении  2  и  4  по  отношению  к  гидроксилу  расположены  донорные  алкильные  заместители.  Показано,  что  при  всех  концентрациях  эмоксипин  тормозит  начальные  и  максимальные  скорости  окисления.  В  присутствии  аллопуринола  и  эмоксипина  наблюдаются  периоды  индукции  и  периоды  аутоускорения  (рис.  6).  Соединения  относятся  к  амино-фенолам  второй  группы.  Вероятно,  в  этих  условиях  лимитирующей  является  реакция  разрушения  амином  гидропероксидов  по  молекулярному  механизму.  Зависимости  периодов  индукции  от  концентрации  эмоксипина,  аллопуринола  и  фентоламина  приведены  в  табл.  4. 

В  качестве  серосодержащего  соединения  в  настоящей  работе  был  изучен  капотен.  Химическая  структура  препарата  позволяет  прогнозировать  его  ингибирующую  активность  за  счет  разрушения  гидропероксидов  меркаптогруппой  или  хелатирования  катализатора. 

На  рис.  7.  Приведены  кинетические  кривые  каталитического  окисления  МЛ  в  водно-эмульсионной  среде  в  присутствии  (1×10^-6—1×10^-1)  М  капотена.  Показано,  что  все  добавки  тормозят  процесс  окисления,  снижая  начальную  и  максимальную  скорости  (табл.  4).  Характер  влияния  капотена  на  кинетику  каталитического  окисления  МЛ  может  быть  объяснен  следующим  образом:  капотен  может  участвовать  в  реакциях  обрыва  цепей,  обеспечивая  ингибирования  процесса  окисления,  снижение  скорости  окисления  может  быть  обусловлено  его  конкурентным  участием  с  катализатором  в  распаде  гидропероксидов  по  молекулярному  механизму,  что  влияет  на  снижение  скорости  разветвления  цепей  и  скорости  процесса  в  целом.

Общим  в  эффекте  всех  аминов  и  серосодержащего  препарата  капотена  является  снижение  максимальной  скорости  процесса,  пропорционально  увеличению  концентрации.  Эффект  уменьшения  начальной  и  максимальной  скорости  окисления  отмечается  для  всех  АО,  кроме  пирокатехина  и  фентоламина,  в  наибольшей  степени  это  влияние  проявляется  в  действии  эмоксипина,  осалмида  и  парацетамола. 

Рисунок  8.  а).  Кинетика  накопления  гидропероксидов  при  аутоокислении  МО  в  присутствии  равных  концентраций  АО:  1  —  контроль,  2  —  эмоксипин,  3  —  капотен.  б).  Кинетика  накопления  гидропероксидов  при  аутоокислении  ЛК  в  присутствии  равных  концентраций  АО:  1  —  контроль,  2  —  осалмид,  3  —  парацетамол.  Стрелкой  показан  вброс  АО.  С  _(АО)=2´10^-4M,  t=60°  C

Для  подтверждения  гипотезы  о  возможном  разрушении  гидропероксидов  под  действием  АО  были  проведены  эксперименты  по  тестированию  кинетики  накопления  гидропероксидов  (ROOH)  с  добавками  в  частично  окисленный  субстрат  каждого  из  исследуемых  АО  (рис.  8  а.  б.).  После  внесения  ингибитора  в  течение  первого  часа  наблюдалось  снижение  концентрации  гидропероксидов,  в  контрольном  опыте  ROOH  продолжали  накапливаться.  Установлено,  что  все  исследуемые  соединения  способствуют  разрушению  гидропероксидов  на  50—75  %. 

Выводы:

1.  Разработана  кинетическая  модель  тестирования  биоантиоксидантов  в  водно-эмульсионной  каталитической  среде,  выбраны  оптимальные  концентрации  катализатора  и  поверхностно-активного  вещества.

2.  Получен  ряд  каталитической  активности  солей  металлов  переменной  валентности:  Cu²⁺  >  Fe²⁺  >  Fe  ³⁺  >  Co²⁺>  Ni²⁺.

3.    Показан  идентичный  механизм  действия  стационарного  антиоксиданта  дибунола  при  окислении  безводных  и  водно-эмульсионных  липидных  субстратов.

4.  Получен  ряд  увеличения  антиоксидантной  активности  полифункциональных  соединений:  фентоламин  <  салициловая  кислота  <  новокаин  <  аллопуринол  <  пирокатехин  <  фенол  <  парацетамол  <  коринфар  <  адреналин  <  метилдофа  <  эмоксипин  <  капотен  <  осалмид  <  дибунол. 

5.  Установлено,  что  исследуемые  соединения  в  процессе  окисления  способны  как  эффективно  уничтожать  пероксильные  радикалы,  так  и  разрушать  гидропероксиды  молекулярным  путем.  Вероятно,  что  антирадикальная  активность  ингибиторов  обусловлена  присутствием  в  их  химической  структуре  фенольного  гидроксила,  а  способность  разрушения  гидропероксидов  связана  с  наличием  амино-,  амидной  или  сульфидной  группы.

Разработанный  способ  тестирования  биоантиоксидантов  волюмометрическим  методом  с  использованием  каталитического  окисления  водно-эмульсионных  липидных  субстратов  был  внедрен  в  НИИ  клинической  и  профилактической  кардиологии  СО  РАМН,  отдел  артериальной  гипертонии  (Авторы  внедрения:  В.Н.  Ушкалова,  Н.В.  Иоанидис,  Г.Д.  Кадочникова,  В.В.  Тихонова,  М.Г.  Перевозкина).

По  результатам  антиоксидантной  активности  ряда  лекарственных  препаратов  различного  фармакологического  действия  было  выявлено  наиболее  эффективное  соединение  —  осалмид.  В  Новосибирском  институте  органической  химии  (НИОХ)  им.  Н.Н.  Ворожцова  СО  РАН  на  базе  структуры  осалмида  была  синтезирована  группа  замещенных  амидов  и  сульфидов  салициловой  кислоты,  имеющих  в  орто-  и  пара-положении  экранирующие  трет-бутильные  заместители.  Сравнительному  тестированию  ингибирующих  свойств  новых  перспективных  соединений  с  целью  выявления  среди  них  активных  антиоксидантов  будет  посвящена  отдельная  работа.

Список  литературы:

1.Арутюнян  Р.С.,  Налбандян  Дж.М.,  Бейлерян  Н.М.  //  Кинетика  и  катализ.  —  1985.  —  Т.  26.  —  вып.  4.  —  №  6.  —  С.  1475—1477. 

2.Владимиров  Ю.А.,  Суслова  Т.Б.,  Оленев  В.И.  Митохондрии.  Транспорт  электронов  и  преобразование  энергии.  М.:  Наука,  1976.  —  109  c. 

3.Денисов  Е.Т.  Элементарные  реакции  ингибиторов  окисления  //  Успехи  химии.  —  1973.  —  Т.  42.  —  вып.  3.  —  С.  361—390.

4.Паничева  Л.П.,  Третьяков  Н.Ю.,  Яковлева  С.А.,  Юффа  А.Я.  Мицелярно-каталитическое  окисление  углеводородов.  1.  Окисление  кумола  кислородом  в  водных  растворах  додецилсульфата  натрия  в  присутствии  сульфата  меди  //  Кинетика  и  катализ.  —  1990.  —  Т.  31.  —  вып.  1.  —  С.  96—101. 

5.Паничева  Л.П.,  Третьяков  Н.Ю.,  Эйхман  С.А.,  Юффа  А.Я.  Мицеллярно-каталическическое  окисление  углеводоров.  2.  Влияние  медных  и  натриевых  солей  лауриновой  и  пальмитиновой  кислот  на  кинетику  окисления  кумола  кислородом  в  присутствии  водной  фазы  //  Кинетика  и  катализ.  —  1991.  —  Т.  32.  —  вып.  1.  —  С.  45—49.

6.Перевозкина  М.Г.  Кинетика  и  механизм  ингибирующего  действия  производных  фенозана,  салициловой  кислоты  и  их  синергических  смесей  с  α-  токоферолом  и  фосфолипидами.  Автор.  …канд.  хим.  наук.  Тюмень.  —  2003.  —  28  с.

7.Перевозкина  М.Г.,  Тихонова  В.В.,  Ушкалова  В.Н.  Каталитическое  окисление  липидных  субстратов  в  присутствии  фенолов  и  аминов  //  В  сб.:  Свободно-радикальное  окисление  липидов  в  эксперименте  и  клинике.  Тюмень,  Из-во  Тюм.ГУ.  —  1997.  —  С.  90—104.

8.Рогинский  В.А.  Фенольные  антиоксиданты.  М.:  Наука.  —  1988.  —  247  с.

9.Русина  И.Ф.  Хемилюминесцентные  методы  в  исследовании  ингибиторов  окисления.  Автор.  …канд.  хим.  наук.  М.:  Институт  химической  физики  им.  Н.Н.  Семёнова  РАН.  —  2011.  —  22  с.

10.Ушкалова  В.Н.,  Перевозкина  М.Г.,  Барышников  Э.В.  Разработка  способа  тестирования  средств  антиоксидантотерапии  //  В  сб.:  Свободно-радикальное  окисление  липидов  в  эксперименте  и  клинике.  Тюмень,  Из-во  Тюм.ГУ.  —  1997.  —  С.  77—82.

11.Эмануэль  Н.М.  Механизм  действия  антиоксидантов.  Современные  представления  //  Нефтехимия.  —  1982.  —  Т.  22.  —  №  4.  —  С.  435—447.

12.Эмануэль  Н.М.,  Майзус  З.К.,  Карпухина  Г.В.,  Мескина  М.Я.  Механизм  синергетического  действия  смесей  ингибиторов  в  процессах  окисления  //  Тез.  междун.  симп.  по  методам  оценки  и  практическому  применению  стабилизаторов  и  синергических  смесей.  М.  —  1973.  —  С.  1—18.      

13. Allen  Y.C.,  Farag  P.A  comparison  between  the  metal-catalysed  autoxidation  of  agueous  emulsions  of  linoleic  acid,  trilinolein  and  phospholipids  3  Symp.  int.  oxide  lipides  catalyses  metaux.  Paris.  —  1974.  —  P.  44—56.

14.Burton  G.W.,  Ingold  K.U.  Autoxidation  of  biological  molecules.  1.  The  antioxidant  activity  of  vitamin  E  and  related  chainbreaning  phenolic  antioxidant  in  vitro  //  J.  Amer.  Chem.  Soc.  —  1987.  —  V.  103.  —  №  21.  —  P.  6472—6477.

15.El-Zeany  B.A.,  Pokorny  Y.,  Yanicek  G.  Effect  of  metallic  compounds  on  the  autoxidation  of  fatty  acids  and  their  derivatives.  4.  Autoxidation  of  fish  oil  fatty  acid  esters  in  mixture  with  protein  in  presence  of  copper  and  iron  salts  //  Sb.  VSCHT  V  Praze.  —  1974.  —  E.  42.  —  P.  5—18.

16.Ohlson  R.  Fats  and  oils  demetalization  :  its  intlulnce  on  their  oxidative  stability  //  3.  Symp.  int.  oxide  lipides  catalises  metaux.  Paris.  —  1973.  —  P.  184—192.

17.Pokorny  J.  Effect  of  metallic  compounds  on  the  autoxidation  of  fatty  acids  and  their  derivatives.  3.  Effect  of  metallic  chlorides  on  the  autoxidation  of  stabilized  isopropyl  oleate  //  Sb.  VSCHT  V  Praze.  —  1969.  —  E.  27.  —  P.  67—81.

18.Pokorny  J.,  Kondratenko  S.S.,  Janicek  G.  Autoxidation  of  some  vegetable  oils  at  elevated  temperatures.  14.  Effect  of  heavymetals  and  inhibitors  on  the  meximum  oxidati  on  rate  of  sunflower  seed  oil  //  Sb.  Vysoke  skoly  chem.  technol.  V  Praze.  —  1967.  —  E.  18.  —  P.  61—66.

19.Pokorny  J.,  Luan  N.T.,  Janicek  G.  Changes  of  to  copherols  in  vegetable  oils  under  the  conditiong  of  deep  fat  frying  //  Sb.  Vysoke  skoly  chemicko  —  technologicke  V  Praze.  —  1973.  —  E.  39.  —  P.  24—41.