ЗАВИСИМОСТЬ ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ BACILLUS SP. ОТ ФАЗЫ РОСТА КУЛЬТУРЫ

DEPENDENCE OF FUNGICID ACTIVITY BACILLUS SP. FROM THE PHASE OF GROWTH OF CULTURE

Dinara Baubekova

senior lecturer Department «Applied biology and microbiology» «Astrakhan State Technical University», leading engineer Research Laboratory microbiological monitoring,

Russia, Astrakhan

АННОТАЦИЯ

Спорообразующие бактерии рода Bacillus перспективны в качестве компонентов биопрепаратов, поскольку сохраняют жизнеспособность и устойчивость к повреждающим воздействиям, технологичны в производстве и применении. Бактерии рода Bacillus синтезируют различные антибиотики, ферменты, сидерофоры, токсины, подавляющие развитие широкого спектра фитопатогенов. Установлено, что исследуемый штамм Bacillus sp. проявлял фунгицидную активность специфично – диаметры зон ингибирования роста фитопатогенов варьировали в зависимости от фазы роста культуры. Определены два пика фунгицидной акивности штамма, которые приходятся на экспоненциальную фазу роста (2 сутки) и фазу отмирания (6–7 сутки). Установлено, что культуральная жидкость штамма оказывает наибольшую фунгицидную активность по сравнению с суспензией штамма.

ABSTRACT

Spore-forming bacteria of the genus Bacillus are promising as components of biologics, since they retain viability and resistance to damaging effects, are technologically productive and in use. Bacteria of the genus Bacillus synthesize various antibiotics, enzymes, siderophores, toxins that inhibit the development of a wide range of phytopathogens. It was found that the strain Bacillus sp. showed fungicidal activity specifically - the diameter of the zones inhibiting the growth of phytopathogens varied depending on the growth phase of the culture. Two peaks of the fungicidal activity of the strain were determined, which fall on the exponential phase of growth (day 2) and the phase of extinction (6-7 days). It was found that the culture liquid of the strain had the greatest fungicidal activity as compared to the suspension of the strain.

Ключевые слова: микроорганизм рода Bacillus; фунгицидная активность; фазы роста культуры; биофунгицид; беспестицидные технологии; сельское хозяйство.

Keywords: microorganism of the genus Bacillus; fungicidal activity; phase of culture growth; biofungicides; non–pesticidal technology; agriculture.

На данный момент в растениеводстве существует актуальная проблема, связанная с разработкой мероприятий для снижения заболеваний сельскохозяйственных культур, возбудителями которых являются фитопатогенные микромицеты. Доказано, что использование методов химической защиты приводит к снижению урожайности культур и плодородия почв; загрязнению окружающей среды и соответственно накоплению токсичных соединений в продуктах питания. Поэтому в настоящее время широкое распространение получили методы биологической защиты сельскохозяйственных культур, в частности, микробиологический метод защиты [6, с. 56].

Микробиологический метод основывается на использовании антагонизма микроорганизмов по отношению к фитопатогенным микромицетам. Данный метод основывается на замене химических препаратов биологическими. Биопрепараты способствуют защите сельскохозяйственных культур от фитопатогенных микромицетов, стимулированию роста и развития культур, оздоровлению. Важной особенностью биопрепаратов является их экологичность. Биопрепараты безопасны для человека, животных и растений, что позволяет работать с ними без специальных мер предосторожности и получать урожай экологически чистой продукции [9, с. 466].

Спорообразующие бактерии рода Bacillus наиболее перспективны в качестве компонентов биопрепаратов, поскольку сохраняют жизнеспособность и устойчивость к повреждающим воздействиям, технологичны в производстве и применении. Использование бактерий рода Bacillus в качестве основы биопрепаратов базируется на антагонистической активности бактерий по отношению к широкому спектру фитопатогенных микромицетов. Бактерии рода Bacillus синтезируют различные антибиотики, ферменты, сидерофоры, токсины, подавляющие развитие различных фитопатогенов. Также они способны стимулировать рост и развитие растений за счет продуцируемых ими фитогормонов, способствуют питанию растений [8, с. 22].

Для бактерий рода Bacillus характерен комплексный механизм подавления роста микромицетов, заключающийся во взаимодействии гидролитических ферментов с антибиотическими веществами [1, с. 357]. Различные ферменты в той или иной мере способны усиливать действие антибиотических соединений. Продуцирование антибиотиков или ферментов происходит в определенную фазу роста микроорганизма, что в свою очередь влияет на проявление фунгицидной активности в разные фазы роста микроорганизма.

Поэтому в настоящее время поиск наиболее активных штаммов микроорганизмов рода Bacillus для борьбы с фитопатогенами и получение на их основе новых биопрепаратов является актуальным вопросом сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии.

Целью исследования являлось изучение зависимости фунгицидной активности Bacillus sp. от фазы роста культуры. Для достижения поставленной в работе цели были использованы различные микробиологические методы исследований [3–5, 7].

Для исследования фунгицидной активности в различные фазы роста культуры, штамм Bacillus sp. культивировали в течение 9 суток при температуре 28 °С при непрерывном перемешивании на качалке (120 об/ мин).

В качестве тест–объекта использовали фитопатогенный микромицет Alternaria tenuissima. В эксперименте исследовалась суспензия и культуральная жидкость штамма, культивируемого на бобовом отваре. Фунгицидная активность штамма Bacillus sp. определялась каждые 24 часа с помощью метода диффузии в агар с использованием лунок. Фунгицидные свойства штамма Bacillus sp. оценивались по диаметрам зон ингибирования роста микромицетов вокруг лунок. Титр клеток определялся каждые 3 часа с помощью показателя фотоэлектроколориметра.

В ходе эксперимента установлено, что при культивировании исследуемого штамма Bacillus sp. на бобовом отваре фунгицидная активность штамма изменялась в зависимости от фазы роста культуры (рис. 1). 

Рисунок 1. Фунгицидная активность суспензии Bacillus sp. в динамике при его культивировании на бобовом отваре

В лаг–фазу (от инокуляции питательной среды суспензией штамма до 24 часов культивирования) диаметры ингибирования роста микромицета очень незначительные (5 мм).  При переходе культуры штамма в экспоненциальную фазу роста фунгицидная активность в период с 1 по 2 сутки культивирования нарастает: диаметр зон – 37 мм. В стационарной фазе роста фунгицидная активность штамма уменьшается до 24,5 затем постепенно увеличивается до 30 мм. В фазу отмирания на 7 сутки фунгицидная активность штамма достигает своего максимума (диаметр зон ингибирования – 39 мм), затем происходит снижение активности до 26 мм на 9 сутки.

Следовательно, пики фунгицидной активности суспензии штамма Bacillus sp. при его культивировании на бобовом отваре приходятся на 2 сутки в экспоненциальную фазу роста с титром клеток 10¹¹ КОЕ/мл и на 7 сутки в фазу отмирания с титром клеток 10¹² КОЕ/мл.

Фунгицидная активность культуральной жидкости штамма Bacillus sp., культивируемого на бобовом отваре, также изменялась в зависимости от фазы роста культуры (рис. 2).

Рисунок 2. Фунгицидная активность культуральной жидкости Bacillus sp. в динамике при его культивировании на бобовом отваре

В лаг–фазу диаметры зон ингибирования роста микромицета незначительные (9 мм). В экспоненциальной фазе на 2 сутки фунгицидная активность культуральной жидкости увеличивается до 44 мм. При переходе культуры из экспоненциальной фазы роста в стационарную фунгицидная активность снижается до 35 мм. На 6 сутки культивирования штамма фунгицидная активность снова повышается до 46 мм и затем постепенно снижается до 38 мм на 9 сутки.

Пики фунгицидной активности культуральной жидкостью штамма с титром 10⁶ КОЕ/мл приходится на 2 сутки в экспоненциальную фазу роста и на 6 и 7 сутки при переходе со стационарной фазы в фазу отмирания штамма с титром культуральной жидкости 10⁸ КОЕ/мл и 10⁷ КОЕ/мл соответственно.

Анализ полученных данных показал, что при культивировании суспензии штамма Bacillus sp. на бобовом отваре, фунгицидная акивность имеет два пика. Максимум фунгицидной активности суспензии штамма приходится на 2 сутки с титром клеток 10¹¹ КОЕ/мл (диаметр зон – 36 мм) и на 7 сутки культивирования с титром 10¹² КОЕ/мл (диаметр зон – 39). При исследовании антагонистических свойств культуральной жидкости штамма, культивируемого на бобовом отваре, наблюдается 3 пика максимального значения фунгицидной активности: на 2 сутки культивирования с титром 10⁶ КОЕ/мл (диаметр зон – 44 мм), на 6 и 7 сутки при переходе с стационарной фазы в фазу отмирания штамма с титром 10⁸ КОЕ/мл и 10⁷ КОЕ/мл (диаметр зон 46 и 45 мм) соответственно.

В ходе исследования установлено, что исследуемый штамм Bacillus sp. проявлял фунгицидную активность специфично, т.е. диаметры зон ингибирования роста фитопатогенов варьировали в зависимости от фазы роста культуры. Отмечено два пика фунгицидной акивности суспензии и культуральная жидкости штамма Bacillus sp., которые приходятся на экспоненциальную фазу роста (2 сутки) и фазу отмирания (6–7 сутки).

Наличие двух максимумов фунгицидной активности при культивировании штамма Bacillus sp., по–видимому, связано с выделением первичных метаболитов (гидролитических ферментов) в экспоненциальной фазе роста, а также вторичных метаболитов (антибиотики) в фазе отмирания, что соответствует мнению Г.Э. Актуганова [2, с. 472] о комплексном механизме подавления роста грибов штаммами рода Bacillus, который заключается во взаимодействии гидролитических ферментов с антибиотическими веществами.

Установлено, что культуральная жидкость штамма Bacillus sp. оказывает наибольшую фунгицидную активность по сравнению с суспензией штамма.

На основании полученных данных лабораторных исследований можно сделать вывод о влиянии фазы роста культуры на проявление фунгицидной активности исследуемого штамма Bacillus sp. Определены два пика фунгицидной акивности штамма Bacillus sp., которые приходятся на экспоненциальную фазу роста (2 сутки) и фазу отмирания (6–7 сутки).

Список литературы:

1. Актуганов, Г.Э. Хитинолитическая активность бактерий Bасillus Cоhn. – антагонистов фитопатогенных грибов / Г.Э. Актуганов, А.И. Мелентьев // Микробиология. 2003. Т. 72. № 3. С. 356–360.
2. Актуганов, Г.Э. Внеклеточные гидролазы штамма Bасillus sp. 739 и их участие в лизисе клеточных стенок микромицетов / Г.Э. Актуганов, Н.Ф. Галимзянова // Микробиология. 2007. Т. 76. № 4. С. 471–479.
3. Зенова, Г.М. Практикум по биологии почв микробиологии: учеб.пособие / Г.М. Зенова, А.А. Степанов, А.А. Лихачева. М. : Изд–во МГУ, 2002. 120 с.
4. Идентификация плесневых грибов. Гифомицеты: метод.пособие по дисциплине «Промышленные микроорганизмы и методы их получения» для студентов специальности 012400 «Микробиология» / С.В. Еремеева. Астрахань : Изд–во АГТУ, 2007. 76 с.
5. Кураков, А.В. Методы выделения и характеристики комплексов микроскопических грибов наземных экосистем : учеб. пособие / А.В. Кураков. М.: МАКС Пресс, 2001. 92 с.
6. Мелентьев, А.И. Аэробные спорообразующие бактерии Bacillus Cohn в агроэкосистемах / А.И. Мелентьев. Рос. акад. наук, Уфимский науч. центр, Ин–т биологии. М. : Наука, 2007. 147 с.
7. Методы выделения, исследования и определения антибиотической активности микроорганизмов, обладающих антагонистическими свойствами / И.С. Дзержинская. Астрахань : Изд–во АГТУ, 2005. 76 с.
8.  Новикова, И.И. Полифункциональные биопрепараты для защиты растений от болезней  / И.И. Новикова //Защита и карантин растений. 2005. № 2. С. 22–24.
9. Чеботарь, В.К. Антифунгальные и фитостимулирующие свойства ризосферного штамма Bacillus subtilis Ч–13– продуцента биопрепаратов / В.К. Чеботарь, Н.М. Макарова, А.И. Шапошников // Прикладная биохимия и микробиология. 2009.  Т. 45.  № 4.  С. 465–469.