ВЛИЯНИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНОВ B. THURINGIENSIS НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ СПОР F. OXYSPORUM И P. INFESTANS

Терпиловский Максим Александрович

старший преподаватель, кафедра общей и биологической химии, ФГБОУ ВПО Ульяновский государственный университет, г. Ульяновск

Климентова Елена Георгиевна

канд. биол. наук, доцент, кафедра общей экологии,
ФГБОУ ВПО Ульяновский государственный университет, г. Ульяновск

E-mail: maxim@terpilovsky.ru

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 12-04-97016-Р_Поволжье_А.

Разработка биологических препаратов для борьбы с вредителями и возбудителями болезней сельскохозяйственных растений требует поиска микроорганизмов, способных синтезировать биоцидные вещества. Бактерии вида BacillusthuringiensisBerliner до недавнего времени использовались исключительно в роли продуцентов инсектицидных токсинов для борьбы с насекомыми-вредителями [9, с. 90]. Однако в последнее время стало известно и о других свойствах, проявляемых метаболитами этих бактерий: антибактериальных, антинематодных и антифунгальных [6, с. 30—31; 11, с. 71—72; 4, с. 18—19; 7, с. 1193]. Известно, что основным токсическим компонентом В. thuringiensis являются белковые дельта-эндотоксины с молекулярной массой от 30 до 130 кДа [12, с. 778—779]. Результаты многочисленных исследований и особенности строения клеток эукариот в целом позволяют говорить об общей природе действия дельта-эндотоксиновB. thuringiensis в отношении клеток насекомых, бактерий и фитопатогенных грибов.

Фитофтороз и фузариоз — одни из самых опасных и наиболее распространенных болезней сельскохозяйственных культур, вызывае­мых микроскопическими грибами и оомицетами. Поражение ими приводит к значительным потерям урожая и ухудшению экологической ситуации, за счет применения большого количества химических пестицидов. Возбудителями этих заболеваний являются грибы родов Phytophthora и Fusarium. В связи с этим представляется актуальным изучение действия дельта-эндотоксинов на клетки данных грибов.

В настоящей работе использовали штамм фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum ВКМ F-845 (из коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Всерос­сийская коллекция микроорганизмов) и оомицета Phytophthorainfestans шт. 2 (из коллекции кафедры микробиологии Казанского федерального университета). Культуры высевали на питательные среды (использовали картофельно-глюкозный агар и модифици­рованную среду Комада) [10, с. 331—332; 1, с. 146—150]. Изучение влияния дельта-эндотоксинов на жизнеспособность спор P. infestans и F. oxysporum проводили на питательной среде по методу Бобек и Ситу [8, с. 644—645]. Все полученные результаты обрабатывались и анализировались с помощью методов математической статистики. Оценивали достоверность всех полученных различий в экспериментах по сравнению с контролем [2]. Количественный учет плотности популяции различных групп микроорганизмов проводили путем подсчета числа колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 см²поверхности.

Инкубирование спор фитопатогенных грибов F.oxysporum и P. infestans в растворах дельта-эндотоксинов различных концентраций с последующим пересевом на питательную среду выявило выраженное антифунгальное действие кристаллических белков B. thuringiensis.

Наиболее эффективной в подавлении числа выросших колоний фитопатогенных грибов P. infestans была концентрация дельта-эндотоксина 800 мкг/мл — в 2,1 раза снижала число КОЕ по сравнению с концентрацией 400 мкг/мл и в 5 раз по сравнению с контролем (рис. 1).

Длительное инкубирование спор фитопатогенных грибов P. infestans (12 ч) в присутствии дельта-эндотоксиновоказывало более выраженное влияние на их жизнеспособность. Так, дельта-эндотоксиныB. thuringiensis в концентрациях 400 и 800 мкг/мл снижали число колоний на 73 и 81 %, соответственно, по сравнению с контролем (рис. 1).

Рисунок 1. Влияние дельта-эндотоксинаB. thuringiensis на число КОЕ грибов P. infestans (время инкубирования — 6 ч)

Рисунок 2. Влияние дельта-эндотоксинаB. thuringiensis на число КОЕ грибов F. Oxysporum

Активность в отношении фитопатогенных грибов F. oxysporum была выше той, которую проявляли дельта-эндотоксиныB. thuringiensisпротив P. infestans. Уже через 6 ч инкубирования отмечали значительное снижение числа колоний по сравнению с контролем на 75 и 84 % для концентраций 400 и 800 мкг/мл, соответственно (рис. 2).

Результаты, полученные при инкубировании спор фитопато­генных грибов F. oxysporum в течение 6 и 12 часов имели примерно схожие показатели (рис. 2).

Дельта-эндотоксин в концентрациях 400 и 800 мкг/мл снижал число выросших колоний в 3,7 и 14 раз, соответственно, по сравнению с контролем. При этом отмечали практически полное ингибирование роста грибов F. oxysporum на питательных средах дельта-эндотоксином в концентрации 800 мкг/мл (рис. 2).

Полученные результаты согласуются с данными других авторов о подавлении дельта-эндотоксинами роста бактериальных и грибных клеток на питательных средах [6, с. 29—30; 5, с. 118; 3, с. 16—18]. Настоящее исследование позволило выявить высокую эффективность подавления эндотоксинами B.thuringiensis роста колоний фитопатогенных грибов F. oxysporum и оомицетов P.infestans. В связи с этим, создание биологических фунгицидных препаратов на основе эндотоксинов B. thuringiensis является очень актуальным и перспективным.

Список литературы:

1. Билай, В.И. Основы общей микологии / В.И. Билай. — Киев: Выща школа, 1989. — 392 с.
2. Гланц, С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. / С. Гланц. — М., Практика, 1998. — 459 с.
3. Климентова, Е.Г. Антагонистическая активность гемолитических Escherichiacoli, выделенных из толстой кишки мышей с экспери­ментальным дисбактериозом, обусловленным действием δ-эндотоксинов Bacillusthuringiensis / Е.Г. Климентова // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. — 2012. — № 3. — С. 13–18.
4. Климентова, Е.Г. Антимикробное действие дельта-эндотоксинаBacillusthuringiensis в отношении ряда фитопатогенных бактерий: Автореф. дис. на соиск. учен.степ. к.б.н.: Спец. 03.00.07 / Климентова Елена Георгиевна; [Ульян. гос. ун-т]. — М.: 2001. — 21 с.
5. Климентова, Е.Г. Изменение микрофлоры толстого кишечника у мышей при длительном пероральном введении δ-эндотоксина Bacillusthuringiensis / Е.Г. Климентова, А.А. Купцова, Л.К. Каменек, В.В. Гулий // Сельскохозяйственная биология. — 2011. — № 4. — С. 115—120.
6. Юдина, Т.Г. Действие дельта-эндотоксинов четырёх подвидов B. thuringiensis на различных прокариот / Т.Г. Юдина, Л.И. Бурцева // Микробиология. — 1997. — Т. 66. — № 1. — С. 25—31.
7. Batista-Junior, C.B. Efeito fungistatico de Bacillus thuringiensis e de outras bacterias sobre alguns fungos fitopatogenicos / C.B. Batista-Junior, U.B. Albino, A.M. Martines, D.P. Saridakis, L.S. Matsumoto, M.A. Avanzi, G. Andrade // Pesq. agropec. bras. — 2002. — V. 37. — № 8. — P. 1189—1194.
8. Bobek, L.A. MUC7 20-Mer: Investigation of Antimicrobial Activity, Secondary Structure, and Possible Mechanism of Antifungal Action / L.A. Bobek, H. Situ // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. — 2003. — V.47. — №2. — P. 643—652.
9. Burges, D.H. Bacillus thuringiensis in pest control / D.H. Burges // Pestic. Outlook. — 2001. — V. 12. — P. 90—98.
10. Caten, C.E. Spontaneous variability of single isolates of Phytophthora infestans. I. Cultural variation / C.E. Caten, J.L. Jinks // Can. J. Bot. — 1968. — V. 46. — P. 329—348.
11. Glare, T.R. Characterisation / T.R. Glare, M. O’Callaghan // In: Bacillus thuringiensis: Biology, Ecology and Safety. — UK West Sussex: John Wiley and Sons Ltd, 2000. — P. 71—79.
12. Schnepf, E. Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins / E. Schnepf, N. Crickmore, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, J. Feitelson, D.R. Zeigler, D.H. Dean // Microbiology and Molecular Biology Reviews. — 1998. — V. 62. — № 3. — P. 775—806.