ЗАГРЯЗНЕННАЯ N-ФОСФОНОМЕТИЛГЛИЦИНОМ ПОЧВА КАК ИСТОЧНИК БИОДЕСТРУКТОРОВ ФОСФОНАТОВ

Бакулин Михаил Константинович

д-р мед.наук, профессор каф. микробиологии
Вятского государственного университета, г. Киров

Бакулин Владимир Михайлович

канд. техн. наук, доцент каф.биотехнологии
Вятского государственного университета, г. Киров

Кондратьева Надежда Сергеевна

аспирант каф.микробиологии
Вятского государственного университета, г. Киров

E-mail: myachina.nadya@mail.ru

Синтетические фосфонаты являются основой многих ксено­биотиков антропогенного происхождения: гербицидов, инсектицидов, пламегасителей, ингибиторов коррозии, боевых отравляющих веществ, продукты разложения которых токсичны для людей и животных и очень устойчивы к разложению в почве, где обнаруживаются спустя десятилетия [5, с. 220].

Разработка биологических методов утилизации токсичных фосфонатов и других фосфорорганических соединений, отходов их производства и продуктов разложения рассматривается россий­скими и зарубежными специалистами в качестве основной альтернативы их сжиганию [8, с. 4067].

В этом плане актуальными являются исследования по созданию биологических консорциумов на основе разных штаммов-биодеструкторов, разработке новых биотехнологических подходов комплексного использования их для уничтожения фосфонатов в природных и искусственных средах [2, с. 2]. Практический интерес представляет использование почвенных псевдомонад, способных разлагать ксенобиотики и одновременно осуществлять биосинтез биологически активных и полезных для растений веществ [7, с. 12].

Сотрудниками биологического факультета ВятГУ был проведен анализ групповой принадлежности и выделение почвенных микроорга­низмов в местах регулярного применения N-фосфонометилглицина (глифосата).

Для тестирования чувствительности псевдомонад к глифосату использовали препарат Раундап («Монсанто», США), содержащий 36 % глифосата.

Для выделения бактерий рода Pseudomonas использовали накопительную среду состава, (г·дм^-3): MgSO₄·7Н₂О — 0,2; К₂НРО₄ — 1,0; FeSO₄·7Н₂О — 0,05; CaCl₂ — 0,02; MnCl₂·4H₂O — 0,002; Na₂MoO₄·2H₂O —0,001; C₂Н₅ОН — 4,0; NH₄Cl — 1,0, вода дистиллированная — до 1 дм³.

В качестве минимальной среды для бакте­рий использовали синтетическую среду следующего состава, (г,мл×дм^-3): К₂НРО₄ — 8,71; 5 М NH₄C1 — 1,0; 0,1 М Na₂S0₄ — 1,0; 62 мМ MgCl₂ — 1,0; 1 мМ СаС1₂ — 1,0; 0,005 мМ (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O — 1,0, микроэлементы — 1,0. Раствор микроэлементов в 10%-ной НС1 содержал, г/л: ZnO — 0,41; FeCl₂·6H₂O — 5,4; МnС1₂·4Н₂О — 2,0; CuCl₂·2H₂O — 0,17; Co Cl₂·6H₂O — 0,48, Н₃ВО₃ — 0,06; рН 7,0.

Для выращивания микробных культур использовали агаризо­ванную (2,0 %) среду Лурия-Бертани и жидкую среду Лурия, содержащие, г/дм³: бактотриптон — 10,0; дрожжевой экстракт 5,0:NaCl — 10,0 (все Difco, США).

Анализ групповой принадлежности почвенных микроорганизмов, получение накопительных и чистых микробных культур проводили общепринятыми методами [1, с. 152; 3, с. 56; 6, с. 421]. Родовую и видовую принадлежность выделяемых получаемых микробных культур проводили с использованием идентификационных тест-систем (наборов) МИКРО-ЛА-ТЕСТ, производства PLIVA — Lachema (Чехия) и прилагаемых к ним Codebook. Количественный анализ содержания глифосата проводили хроматографическим методом [4, с. 243].

Микробную обсемененность исследовали в пробах почвы, отобранных на участках сельхозугодий в Оричевском и Нововятском районах Кировской области, которые многократно подвергались воздействию N-фосфонометилглицина. В качестве контрольных одновременно отбирались пробы в районе тех же участков, не в тех же районах. При каждой обработке методом распыления расход на 100 м² поля, предназначенного под посев овощных культур и картофеля, в среднем составлял 5 литров воды, содержащей 65—70 мл 36 %N-фосфонометилглицина. В июле 2011 г было отобрано четыре группы по 7 проб в каждой: 1 группа — пробы почвы, не обрабатываемой ранее гербицидами (контроль почвы перед обработкой N-фосфонометилглицином); 2 группа — пробы почвы обработанной 5—8 раз в предшествующие три года (2008—2010 гг.) в весенне-летний период, при этом с последней обработки прошел год; 3 группа — пробы почвы обработанной однократно в конце мая — начале июня 2011 гг., с обработки до взятия пробы прошло три недели; 4 группа — пробы почвы обработанной 5—8 раз в предшествующие три года (2008—2010 гг.) в весенне-летний период и дополнительно — однократно в течение мая — июня 2011 гг., с последней обработки до взятия проб прошло три недели. Результаты анализов свидетельст­вовали, что численный состав и соотношение популяций микроорга­низмов менялись в зависимости от количества обработок гербицидом.

В 1 группе (контрольной) проб средняя концентрация микроорганизмов составляла 8×10⁷ КОЕ/г, в 2—4 группах, 2×10⁷; 7×10⁴; 4×10⁶ соответственно. Полученные результаты свидетель­ствуют, что обработка гербицидом почвы приводит к резкому снижению концентрации микроорганизмов в ней, через три недели после однократной обработки N-фосфонометилглицином количество микроорганизмов снижалось до 7×10⁴ или более чем в 10³ раз меньше, чем в контроле. Через год после обработки гербицидом концентрация микроорганизмов в почве в значительной степени восстановилась, но была ниже, чем в контроле в 4 раза. Результаты анализа четвертой группы проб свидетельствовали, что микрофлора почвы, регулярно подвергавшейся обработке глифосатом, стала устойчива к повторным воздействиям гербицида и быстрее восстанавливалась: через три недели после обработки содержание микроорганизмов в пробах группы 4 было в 57 раз выше, чем в пробах группы 3.

Исследование изменений содержания микроорганизмов разных групп (в процентах от общего их количества в пробах) в зависимости от кратности и сроков обработки глифосатомпоказало, что в результате многократной обработки гербицидом количество протеобактерий снижается (по отношению к контролю) с 57 % до 16 %, микромицетов повышается с 11 % до 41 %, содержание грамположительных бактерий, актиномицетов и цианобактерий в пробах колеблется соответственно на уровне 21—29 %; 2—7 % и 6—12 % соответственно.

В ходе исследований в пробах почвы были выделены и идентифицированы 20 изолятов бактерий рода Pseudomonas, относящихся к родам aeruginosa,fluorescens, mendocina, pseudoalcaligenes, putida, stutzeri, которые обладали более выраженной устойчивостью к токсическому действию глифосата в сравнении с контрольными лабораторными штаммами не контактировавшими с глифосатом.

При этом три изолята (два — P. fluorescens и один — P. putida), составляющие 15 % от всех выделенных культур, были способны к росту в жидкой среде, содержащей 0,4 мкг/см³N-фосфонометил­глицина, 13 изолятов (65 %) и 4 изолята (20 %) псевдомонад были способны к росту в жидкой среде, содержащей соответственно 0,1 и 0,025 мкг/см³N-фосфонометилглицина.

Проведенные исследования позволили сделать выводы:

1.Многократное применение глифосата в качестве гербицида приводит к изменению структуры микробного сообщества почвы за счёт снижения относительных концентраций протеобактерий с 57 % до 16 %, актиномицетов — с 7 % до 2 %, и возрастания содержания микромицетов с 11 % до 41 %, грамположительных бактерий с 21 % до 29 %, цианобактерий — с 6 % до 12 %.

2.Устойчивость отдельных изолятов P. fluorescens и P. putidaболее чем в 6 раз превосходила устойчивость лабораторных штаммов этих же родов, которые не были в контакте с N-фосфонометил­глицином.

Список литературы:

1. Виноградский С.Н. Микробиология почвы. Изд-во АН СССР, 1952. — 370 с.
2. Жариков М.Г. Эколого-токсикологическая оценка воздействия глифосата при многолетнем применении на элементы агроценоза и биоремедиация загрязненных территорий: автореф. дис. на соиск. уч. степ.канд. биол. наук. М.: 2010, МСХА им. К.А. Тимирязева. — С. 1—20.
3. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: Изд-во МГУ, 2005. — 445 с.
4. Клисенко М.А., Калинина А.А., Холькова Г.А. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде: справочник в 2 т. М.: Колос, 1992. Т 1. — 567 с.
5. Кононова С.В., Несмеянова М.А. Фосфонаты и их деградация микро­организмами // Биохимия. — 2002, Т. 67, Вып. 2, № 6. — С. 220—233.
6. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. и др. Практикум по микро­биологии. М.: Академия, 2005. — 608 с.
7. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук. дум., 1990. — 264 с.
8. Moneke A.N., Okpala G.N., Anyanwu C.U. Biodegradation of glyphosate herbicide in vitro using bacterial isolates from four rice fields African // Journal of Biotechnology. — 2010. — Vol. 9 (26). — P. 4067—4074.