ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВОЗДЕЙСТВИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ИНФРАКРАСНОГО И КРАСНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА РОСТ КУЛЬТУРЫ ЛАКТОБАКТЕРИЙ

Чухрай Ирина Георгиевна

канд. мед. наук, доцент кафедры терапевтической стоматологии, БелМАПО, г. Минск

Марченко Елена Ивановна

канд. мед. наук, доцент кафедры терапевтической стоматологии, БелМАПО, г. Минск

Бобкова Ирина Леонидовна

аспирант кафедры терапевтической стоматологи,и БелМАПО, г. Минск

Водчиц Александр Иванович

канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр., Институт физики НАН Беларуси, г. Минск

Батай Людмила Евгеньевна

канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр., Институт физики НАН Беларуси, г. Минск

Дудко Наталья Владимировна

начальник лаборатории исследований и испытаний частного унитарного предприятия «Диалек», г. Минск

E-mail: sovenokby@tut.by

Аннотация. Болезни пародонта характеризуются высокой рас­пространенностью у взрослого населения. Актуален поиск новых эффективных методов лечения гингивитов и пародонтитов. Одним из путей повышения эффективности лечения данной патологии является применение комплексных методов лечения, основанных на сочетании лазерного излучения с медикаментозным воздействием. Целью работы являлось исследование влияния низкоинтенсивного лазерного излуче­ния инфракрасного и красного спектра на рост культуры лактобакте­рий, являющихся действующим началом пробиотического препарата «Диалакт» (УП «Диалек», РБ).

Введение. Болезни пародонта относятся к числу наиболее рас­пространенных стоматологических заболеваний. Так, по данным эпидемиологических исследований, проведенных в Республике Бела­русь в 2006 году, у пациентов возрастной группы 35—44 года болезни пародонта зарегистрированы в 92,5±1,3 % случаев. Взаимосвязь патологии пародонта с общим состоянием здоровья пациентов, уста­новленная многочисленными научными исследованиями, обуслов­лена нарушениями метаболизма, гемодинамики, нейрорегуляции, иммуно­логического статуса, а также сдвигами микробиоценоза. Хроническая системная патология и заболевания пародонта способны оказывать друг на друга взаимоотягощающее влияние, при этом традиционные лечебные воздействия у таких пациентов зачастую оказываются недос­таточно результативными [13]. Учитывая высокую частоту встречае­мости системных заболеваний у пациентов с патологией пародонта, актуален поиск новых эффективных методов лечения с использова­нием средств, оказывающих комплексное воздействие на ткани пародонта.

Лазерная терапия, основанная на использовании низкоинтен­сивного лазерного излучения (НИЛИ), относится к числу наиболее перспективных методов в современной физической медицине. Данный вид излучения в последнее время широко используется для лечения различных стоматологических заболеваний. Значительное влияние на результат воздействия НИЛИ оказывает длина волны, которая опре­деляет глубину проникновения лазерного излучения. В лазерной терапии обычно применяется световое излучение в красном и ближнем инфракрасном спектральном диапазоне. Действие его на организм связано с поглощением лучей поверхностными слоями кожи и слизис­тых оболочек. Данное излучение обладает анальгезирующим, противо­воспалительным действием, ликвидируют отек и гипоксию в тканях за счет улучшения микроциркуляции, стимулирует регенерацию путем стимуляции дифференцировки фибробластов. Под воздействием лазер­ного света на твердые ткани зуба усиливается метаболизм клеточных элементов пульпы. При облучении эмали происходят структурные изменения, способствующие увеличению содержания кальция и фос­фора, уменьшающие кислотное растворение эмали (Myers M.L, 1991).

Такие параметры излучения генерируют лазерные аппараты производства РБ Снаг (0,81 мкм, 0,98 мкм, 1,06 мкм), Родник-1 (0,845—0,9 мкм, 0,67 мкм), Люзар-МП (0,82 мкм, 0,6 мкм), «Вектор -03; -04» (0,65 мкм), Матрикс-стоматолог (0,81 мкм, 0,633 мкм), Милта-Ф-5-01(0,85-0,95 мкм, 0,63 мкм), Узор-А-2К-Профи (0,86 мкм, 0,63 мкм), Шатл-комби (0,632 мкм, 0,87 мкм), Скаляр-панатрон (0,86 мкм, 0,63 мкм) , Латон (0,84 мкм, 0,65 мкм) , Лост-02 (0,65 мкм), Рефтон-01-ФЛС (0,65 мкм), которыми оснащены учреждения здравоохранения.

Одним их путей повышения эффективности лазерной терапии является применение комплексных методов лечения, основанных на сочетании лазерного излучения с медикаментозным лечением [16]. Поскольку ведущая роль в развитии болезней пародонта принадлежит микроорганизмам, целесообразно включение в схему лечения препара­тов, оказывающих воздействие на патогенную микрофлору.

В настоящее время перспективным направлением в медицине является использование пробиотиков — лекарственных препаратов, которые содержат в составе живые микроорганизмы, являющиеся представителями нормальной микрофлоры человека. Постоянная микрофлора полости рта служит биологическим барьером, препятст­вующим размножению патогенной флоры. Среди представителей нор­мального микробиоценоза полости рта наибольшее физиологическое значение принадлежит роду Lactobacillus. Лактобациллы – микро­аэрофильные, грамположительные бактерии, не образующие спор и не продуцирующие каталазу. Они входят в состав резидентной микро­флоры полости рта. Их количественное содержание в полости рта здоровых людей составляет 10³—10⁴ КОЕ/мл [2]. Антагонизм молоч­нокислых бактерий в отношении микроорганизмов обусловлен образо­ванием молочной кислоты, продукцией других антимикробных и антибиотикоподобных субстанций: лизоцима, перекиси водорода, бактериоцинов (лактацинов), короткоцепочечных жирных кислот, диацетила [2, 6, 15], а также конкуренцией за рецепторы для адгезинов на поверхности клеток макроорганизма. Пробиотики, содержащие лактобактерии, также оказывают иммуностимулирующее действие, не имеют побочных эффектов и противопоказаний при местном исполь­зовании [3, 4]. Учитывая различные патогенетические механизмы влияния НИЛИ и пробиотика, представляется перспективным исполь­зование их сочетанного воздействия при лечении заболеваний паро­донта. Выбор препарата, содержащего лактобактерии, обусловлен так­же их более эффективным восстановлением нормальной микрофлоры при пародонтитах по сравнению с бифидумбактериями [3].

Однако вопросы взаимодействия живых культур пробиотиков с лазерным излучением, широко применяемым в стоматологической практике, требуют тщательного изучения. В литературе имеются весь­ма противоречивые сведения, касающиеся оценки воздействия низко­интенсивного лазера на живые микроорганизмы [11, 14]. Некоторые авторы утверждают, что НИЛИ не оказывает выраженного непосредст­венного бактерицидного или бактериостатического действия на мик­робную клетку. В других исследованиях отмечают положительное влияние НИЛИ на рост некоторых микроорганизмов [10].

Выбор оптимальных длин волн излучения (в том числе не совпа­дающих с традиционно используемыми), с точки зрения отсутствия угнетающего воздействия на рост лактобактерий, входящих в состав пробиотика, представляет актуальную практическую задачу.

Целью работы являлось исследование влияния низкоинтенсив­ного красного и инфракрасного лазерного излучения спектральных областей ~ 0,65 мкм, ~ 0,81 мкм, ~ 1,3 мкм и ~ 2 мкм в дозе облучения 0,6 Дж/см² на рост культуры лактобактерий, входящих в качестве основного действующего начала в состав отечественного пробиоти­ческого препарата «Диалакт» (УП «Диалек», Республика Беларусь).

Материалы и методы. В качестве излучателей использовались: лазерные диоды (номинальная длина волны излучения в максимуме — 0,65 мкм (аппарат «Вектор -03» (УП Азгар, РБ) и 0,806 мкм при температуре 25 ⁰С (производитель — «ATC», C.-Петербург, Россия), диодно-накачиваемый неодимовый лазер, генерирующий в канале ~ 1,3 мкм и диодно-накачиваемый тулиевый лазер (эксперименталь­ный образец, длина волны излучения в максимуме — 1,96 мкм, шири­на спектра ~ 10 нм), генерирующие в непрерывном режиме. Излучение лазеров выводилось в кварцевый оптический световод с диаметром ядра 600 мкм, стыкующийся со специальной насадкой, обеспечиваю­щей сглаженное распределение интенсивности выходного излучения на площади ~1 см². Облучение бактериальных культур проводилось при плотности мощности излучения 15 мВт/см², время воздействия составляло 40 с, что соответствовало дозе 0,6 Дж/см². Данные парамет­ры облучения были разработаны на кафедре терапевтической стомато­логии БелМАПО в рамках государственной научно-технической про­граммы по теме «Разработать хирургический метод лечения заболева­ний тканей пародонта и апикального периодонта с использованием препарата гидроксиапатита и низкоинтенсивного лазера» [8, 9].

В качестве лекарственного средства нами был использован пре­парат «Диалакт» производства Республики Беларусь. Действующее на­чало «Диалакта» представляет собой лиофилизированную микробную массу живого антагонистически активного штамма лактобактерий (Lactobacillus acidophilus Ke-10). В одной дозе препарата содержится не менее 10⁸ живых особей лактобацилл. Вспомогательными компо­нентами являются цитрат натрия (0,15 %), молоко сухое обезжиренное (до 15 %). Сухой препарат «Диалакт» готовили к применению сог­ласно инструкции фирмы-производителя, после чего получали разве­дения -2 (10⁷), -3 (10⁶) и -4 (10⁵), в которых наблюдали изолированный рост колоний лактобактерий. Подготовленный препарат объемом 0,1 мл равномерно наносили на селективную питательную среду Рого­за-Шарпа-Мана, предварительно разлитую в чашки Петри. Облучение культуры лактобактерий производили через отверстие площадью ~1 см² специального стерильного шаблона, после чего чашки Петри устанавливали в эксикатор и помещали в термостат на 48 часов при температуре 37⁰С. Подсчет числа выросших колоний производили на третьи сутки. При этом общую площадь чашки Петри условно делили на 4 равных сегмента, два из которых подвергали облучению. Подсчет количества колоний в этих сегментах позволял оценить влияние НИЛИ на жизнедеятельность лактобактерий. Число колоний в двух других сегментах, не подвергавшихся облучению, составляло конт­рольное значение. В ходе эксперимента было изучено 612 образцов. Данные о количестве и структуре исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1

Количество микробиологических исследований

Статистическая обработка экспериментальных данных произво­дилась с использованием программного пакета «Статистика 8». Разли­чия считались достоверными при уровне значимости p<0,05.

Результаты.

Полученные результаты представлены в табл. 2—5.

Таблица 2

Количество колоний лактобактерий после воздействия НИЛИ с длиной волны 0,65 мкм

Статистическая обработка экспериментальных данных показала, что при облучении культуры лактобактерий НИЛИ с длиной волны 0,65 мкм в разведении –2 количество колоний лактобактерий в опыте по сравнению с контролем возросло, однако увеличение оказалось статистически недостоверным. При изучении влияния этой длины волны на культуру в разведении –3 полученные данные достоверно различались (78 [19;248] и 69,5 [13;273,5] соответственно), а при облучении культуры в разведении –4 количество колоний по сравнению с контролем возросло в 1,3 раза.

Таблица 3

Количество колоний лактобактерий после воздействия НИЛИ с длиной волны 0,81 мкм

При облучении культуры НИЛИ с длиной волны 0,81 мкм во всех трех разведениях не было получено статистически значимых различий.

Облучение культуры лактобактерий в разведении –2 и –4 лазер­ным излучением с длиной волны 1,3 мкм выявило статистически достоверные различия между группами. Количество колоний лакто­бактерий в опытной группе увеличилось на 30 % по сравнению с конт­рольной. Воздействие излучения с теми же параметрами на культуру в разведении –3 не привело к достоверным изменениям (табл. 4).

Таблица 4

Количество колоний лактобактерий после воздействия НИЛИ с длиной волны 1,3 мкм

Таблица 5

Количество колоний лактобактерий после воздействия НИЛИ с длиной волны 2 мкм

При облучении культуры лактобактерий лазером с длиной волны 2 мкм количество колоний по отношению к контролю возрастало в 1,5 раза при разведении препарата в степенях –2 и –4, и в среднем в 1,4 раза при разведении в –3 степени.

Можно предположить, что начальным пусковым моментом био­логического действия низкоинтенсивного лазерного с длиной волны 0,65 мкм является локальный нагрев, который вызывает высвобож­дение ионов кальция из внутриклеточного депо и распространение их в цитозоле клетки, что инициирует различные кальцийзависимые процессы [16]. После этого в живых тканях развиваются такие вторич­ные адаптационные и компенсаторные реакции, как активизация мета­болизма клеток, повышение их функциональной активности и др.

Лазерное излучение спектрального диапазона 0,8 мкм широко используется как в терапии, так и хирургической медицинской прак­тике, в том числе в стоматологии. Терапевтические стоматологические лазеры данного диапазона спектра в основном представлены различ­ными лазерными диодами (~800—830 нм, ~980 нм). Не вызывают сомнения различные биологические эффекты, возникающие в ответ на воздействие данного излучения. Низкоинтенсивное лазерное излуче­ние спектральной области 0,8 мкм обладает противовоспалительным, противоотечным, противомикробным, обезболивающим действием, нормализует микроциркуляцию в тканях периодонта и слизистой обо­лочки полости рта, усиливает регенерацию тканей (в том числе кост­ной). Можно полагать, что основным механизмом действия таких лазе­ров является поглощение их излучения молекулой гемоглобина, коэффициент поглощения которого в данной области значительно выше в сравнении с другими молекулярными компонентами крови. Отсутствие данного первичного акцептора в культуре лактобактерий позволяет объяснить отсутствие выраженного влияния излучения спектральной области 0,8 мкм на их жизнедеятельность.

Эффект воздействия излучения с длиной волны ~1,3 мкм на культуру лактобактерий, в соответствии с литературными данными, можно связать с тем, что лазерный свет с такими параметрами генери­рует высокоэнергетический синглетный (возбужденный) кисло­род [14, 16]. Последний, воздействуя на клеточные мембраны, изме­няет антигенные свойства тканей, ведет к изменению структуры ряда соединений, содержащих двойные химические связи — его акцепторы (пуриновых и пиримидиновых оснований, ненасыщенных жирных кислот, фосфолипидов и т. д.). После этого в живых тканях развивают­ся такие вторичные адаптационные и компенсаторные реакции, как активизация метаболизма клеток, повышение их функциональной активности и др.

Эффект влияния излучения с длиной волны ~2 мкм, на культуру лактобактерий, по-видимому, можно связать с наличием универ­сального первичного акцептора в этой спектральной области. Извест­но, что данная область совпадает с одним из интенсивных максимумов поглощения воды, в котором коэффициент поглощения приближается к 100 см^-1.

При выборе параметров лазерного излучения необходимо учитывать оснащение учреждений здравоохранения аппаратами. Следует констатировать тот факт, что с учетом влияния изученных нами длин волн НИЛИ на культуру пробиотика, на сегодняшний день из всего имеющегося ассортимента доступны приборы, генерирую­щими излучение с длиной волны 0,65 мкм.

Выбирая разведение пробиотика для непосредственного исполь­зования при лечении заболеваний пародонта, следует принимать во внимание состояние кислотно-основного равновесия полости рта. В норме pH десневой жидкости составляет 6,8—7,0. Водородный показа­тель (pH) содержимого пародонтального кармана снижается до 5,8—6,2. Кислотность раствора пробиотика в разведениях -2, -3 и -4 состав­ляет 4,27, 4,54 и 5,53 соответственно. С этой точки зрения целесооб­разным представляется использование раствора пробиотика в мини­мальном разведении.

Выводы.

1. Выявлена селективность стимулирующего воздействия ла­зерного излучения на рост культуры лактобактерий по отношению к длине волны.
2. Достоверное увеличение количества колоний лактобактерий зарегистрировано при облучении пробиотической культуры при дли­нах волн 0,65 мкм (разведения –3 и –4), 1,3 мкм (разведения –2 и –4) и 2 мкм в разведениях –2, –3 и –4 при плотности потока мощности 15 мВт/см и дозе облучения 0,6 Дж/см².
3. Для применения в стоматологической практике на сегодняш­ний день можно рекомендовать применение НИЛИ с длиной волны 0,65 мкм (плотность потока мощности 15 мВт/см, доза облучения 0,6 Дж/см²) в сочетании с препаратом «Диалакт» в разведении –4.
4. Полученные научные данные о влиянии НИЛИ с длиной волны 1,3 и 2 мкм на рост культуры лактобактерий являются перспек­тивными и могут быть использованы при разработке новых лазерных аппаратов для медицинского использования.

Список литературы:

1. Бондаренко В. М., Рубакова Э. И., Лаврова В. А. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков // Микробиология, эпидемиология и иммунология. 1998. № 5. С. 107—112
2. 2.        Глушанова Н. А. Биологические свойства лактобацилл // Бюллетень сибирской медицины. 2003. — № 4. — С. 50—58
3. Грудянов А. И., Дмитриева Н. А., Фоменко Е. В. Применение пробиотиков в комплексном лечении воспалительных заболеваний пародонта. — М., 2006. — 112 с.
4. Давыдова Т. Р., Карасенков Я. Н., Хавкина Е. Ю. К проблеме дисбиоза в стоматологической практике // Стоматология. 2001. Т. 80. № 2. С. 23—24.
5. Иванов А. С. Руководство по лазеротерапии стоматологических заболеваний. — СПб: СПбГМА, 2000. — 69 с.
6. Ленцнер А. А., Ленцнер Х. П., Микельсаар М. Э. и др. Лактофлора и колонизационная резистентность // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. Т. 32. ‹ 3. С. 173—179.
7. Марченко Е. И., Чухрай И. Г., Бобкова И. Л. Характеристика пробиотиков белорусского производства // Образование, трудовая организация, профи­лактика и новые технологии в стоматологии: сборник трудов, посвящен­ных 50-летию стоматологического факультета БГМУ.— Минск, 2010.— С. 164—165.
8. Марченко Е. И., Чухрай И. Г., Ковецкая Е. Е., Бобкова И. Л., Байтус Н. А. Новые подходы к лечению хронических заболеваний периодонта // Фун­даментальные и прикладные аспекты воспаления. Материалы междуна­родной научно-практической конференции. — Минск, 2011. — С. 64—66.
9. Марченко Е. И., Чухрай И. Г., Ковецкая Е. Е., Бобкова И. Л., Байтус Н. А. Современные подходы к лечению хронических заболеваний периодонта. Материалы конгресса «Новые подходы в системе последипломного обучения и подготовки специалистов». «Актуальные вопросы меди­цинской науки и практики: к 80-летию БелМАПО, 2011. — С. 253—254.
10. Монич В. А., Малиновская С. Л., Махрова Т. В., Малиновский Д. С. Особенности воздействия низкоинтенсивных электромагнитных излучений различных диапазонов на микроорганизмы. Вестник Нижегородского ун-та им. Н.И.Лобачевского, 2010, № 2(2). С. 435—438.
11. Петрова М. Б., Павлова Н. В., Харитонова Е. А., Шестакова В. Г. Воздействие красного и инфракрасного импульсных лазеров на заживление инфицированных ран. Вопросы морфологии XXI века. Вып.1.— СПбГМА, 2008. — С. 237—241.
12. Тюрин М. В., Шендеров Б. А.. Рахимова Н. Г. и др. К механизму антагонистической активности лактобацилл // Журн. микробиол. 1989. ‹ 2. С. 3—8.
13. Чухрай И. Г., Марченко Е. И., Бобкова И. Л. Общесоматический статус пациентов с заболеваниями периодонта. Стоматология Беларуси в новом тысячелетии. Материалы 9-ой международной научно-практической конференции по стоматологии в рамках 6-ой международной специализированной выставки «Стоматология Беларуси 2010». — М., 2010.— C. 95—97.
14. Шестерина М. В., Калюк А. Н., Малиев Б. М. Влияние гелий-неонового лазерного излучения на условно-патогенные микроорганизмы // Врачебное дело. 1987. — № 8. — С. 53—56.
15. Jay J. M. Antimicrobial properties of diacetyl // Appl. Environ. Microbiol. 1982. ‹ 44. P. 525—532.
16. Ulashcyk V. S., Volotovskaya A. V. Current and long-term technologies of laser therapy // Proceedings of SPIE. — 2007. — V. 6734. — P. 118—123.