АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БИОКОНТРОЛЬНЫХ АГЕНТОВ TRICHODERMA ASPERELLUM И BURKHOLDERIA TERRAE

Романова Ирина Валерьевна

студент 4 курса кафедры биохимии КФУ, г. Казань

Е-mail: romanova_irina_@inbox.ru

Тазетдинова Диана Ирековна

 к. б. н., ассистент кафедры биохимии КФУ, г. Казань

Е-mail: 

Алимова Фарида Кашифовна

д. б. н., профессор кафедры биохимии КФУ, г. Казань

Е-mail: farida_alimova@hotmail.com

Грибы рода Trichoderma используются для биологической борьбы с болезнями растений благодаря их антагонистическим свойствам по отношению к фитопатогенным микроорганизмам [3]. В природной среде они существуют вместе с бактериями-спутниками. Известно, что бактериями-спутниками грибов рода Trichoderma являются бактерии Burkholderia terrae (ранее относились к роду Pseudomonas). Эти бактерии также используются для биоконтроля фитопатогенов в сельском хозяйстве. Этот вид обладает способностью мигрировать в почве на гифах грибов, что редко встречается в природе [5]. Подавление фитопатогенов биоконтрольными микроорга­низмами происходит во многом благодаря синтезу последними литических ферментов. Ключевую роль здесь играют хитиназы — ферменты, катализирующие расщепление хитина, основного компонента клеточных стенок фитопатогенных грибов. В связи с вышесказанным целью данной работы было изучить антагонистические свойства Trichoderma asperellum и Burkholderia terrae. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1.    Изучить антагонистическую активность T.asperellum и ее совместной культуры с B.terrae по отношению к фитопатогену Fusarium spp. методом встречных культур.

2.    Изучить хитиназную активность чистых культур T.asperellum, B.terrae и их совместной культуры.

Определение антагонистической активности проводился методом встречных культур [2].

Нами исследовались три варианта культур: чистая культура T.asperellum (20∙10⁶ кл/мл), чистая культура B. terrae (60∙10⁶ кл/мл), их смешанная культура, культура Fusarium (22,5∙10⁶ кл/мл) и их разведения в 10 и 50 раз. Подсчет клеток бактерий и спор грибов для соответствующих разведений проводился с использованием счетной камеры Тома-Горяева.

В ходе эксперимента наблюдали за антагонистическими отношениями смешанной культуры T. asperellum и B. terrae и фитопатогеном Fusarium в различных соотношениях. В качестве контроля выступала чистая культура T.asperellum с фитопатогеном Fusarium, а также чистая культура Fusarium, T. asperellum, смешанная культура T. asperellum и B. terrae. Для описания типов взаимоотношений между исследуемыми организмами использовали модифицированную шкалу Джонсона и Карла. Степень подавления радиального роста фитопатогена подсчитывали по формуле:

(С — Т)/С ×100%,

где С — расстояние проходимое фитопатогеном без взаимодействия с антагонистом (контроль), Т — расстояние проходимое фитопатогеном при взаимодействии антагонистом — опыт.

Для исследования ферментативной активности исследуемые три варианта культур микроорганизмов выращивали на жидкой среде Чапека в приведенных выше концентрациях. В качестве индуктора фермента в среду были добавлены специально приготовленные клеточные стенки Fusarium spp. [4]. Культуры выращивали в течение 8 суток с постоянным перемешиванием 160 об/мин при температуре 28ºС. Пробы отбирали на 1, 3, 6 и 8 сутки. Для определения активности хитиназы в полученных культуральных жидкостях микроорганизмов использовали ДНС-метод [1], основанный на определении активности фермента по количеству образующихся в результате реакции редуцирующих сахаров с коллоидным хитином в качестве субстрата. Количество восстанавливающих сахаров определяли путем регистрации оптической плотности при длине волны 570нм. Полученные значения переводили по калибровочной кривой, построенной с известными концентрациями N-ацетил-B-глюкозамина. Общую активность фермента выражали в мкМ образовавшегося N-ацетил-D-глюкозамина в расчете на 1 мл раствора фермента за 1 минуту инкубации. Удельную активность выражали в мкМ N-ацетил-D-глюкозамина в расчете на 1 мг белка. Для определения удельной активности фермента определяли концентрацию белка в культуральной жидкости микроорганизмов сравнением поглощения при 280 и 260 нм.

В результате проведенных экспериментов было показано, что как T.asperellum, так и ее смешенная культура с B.terrae обладают антагонистической активностью по отношению к фитопатогену Fusarium.

Рисунок 1. Антагонистическая активность :
A — T.аsperellum-Fusarium на 10-е сутки, B — T.asperellum-B.terrae-Fusarium на 5-е сутки, С — Fusarium, D — T.asperellum-B.terrae-Fusarium на 10-е сутки. Концентрации: T.аsperellum – 0,4∙10⁶ кл/мл, Fusarium— 22,5∙10⁶ кл/мл, B.terrae — 60∙10⁶ кл/мл.

По шкале Джонсона и Карла тип взаимоотношения смешанной культуры T.asperellum и В. terrae с Fusarium относится к E-типу c микопаразитизмом; чистой культуры T.asperellum и Fusarium — к D-типу (антагонист обрастает колонию патогена).

Таблица 1.

Ингибирование линейного роста Fusarium spp.

Наибольшая степень ингибирования линейного роста патогена (82,2%) отмечена при соотношении с антагонистом 1:50 и максимальной концентрацией клеток B.terrae. При снижении концентрации T.asperellum в 10 и 50 раз по сравнению с патогенном уровень ингибирования роста Fusarium значимо не снижается. Соотношение Fusarium с антагонистом 50:1 приводит к ингибированию его линейного роста на 65%, что говорит о высокой антагонистической активности исследуемых штаммов по отношению к Fusarium. В опыте со смешанной культурой достоверных различий в вариантах с тремя концентрациями B. terrae не наблюдали.

Таким образом, в целом, наличие В.terrae на мицелии T.asperellum не оказывало влияния на линейный рост Fusarium, но меняло тип антагонистических отношений между Fusarium и T.asperellum, усиливая антагонистические свойства последней, проявляющиеся в активном лизисе мицелия патогена.

В ходе изучения хитиназной активности культуральных жидкостей исследуемых микроорганизмов было показано ее наличие для всех тест-штаммов. На среде Чапека с клеточными стенками Fusarium spp.максимальная активность хитиназы наблюдалась у T.asperellum (5,46мкМ/мл) и у В.terrae (3,48мкМ/мл) на третьи сутки. У совместной культуры — на шестые сутки (4,97мкМ/мл). Максимальная удельная активность хитиназы у T.asperellum и смешанной культуры отмечена на 6-е сутки — 4,24мкМ/мг и 7,67мкМ/мг соответственно. У В.terrae на 3-и сутки — 4,7мкМ/мг. Снижение ферментативной активности на 6 сутки наблюдается в культуральных жидкостях B.terrae и T.asperellum; на 8 сутки — у смешанной культуры микроорганизмов.

Полученные результаты позволяют нам говорить о перспективности использования исследуемых штаммов в биоконтроле болезней растений.

Список литературы:

1.        Алимова, Ф. К. Методы определения гидролаз почв и почвенных микроорганизмов [Текст] / Ф. К. Алимова. — Казань: Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина, 2010. — 68 с.

2.        Егоров, Н. С. Практикум по микробиологии [Текст] / Н. С. Егоров. — Москва: Издательство Моск. ун.-та, 1976. — 307 с.

3.        Druzhinina, I. Trichoderma: the genomics of opportunistic success [Text] / I Druzhinina, Seidl-Seiboth V, Herrera-Estrella A, Horwitz BA, Kenerley CM, Monte E, Mukherjee PK, Zeilinger S, Grigoriev IV and CP Kubicek // Nature Reviews Microbiology, — 2011. — Vol.9. - P. 749 – 759.

4.        Mitchel, A. Cell-wall proteins of Aspergillus niger and Chaetomium globosum [Text] / A Mitchel, A E Taylor // Gen Microbiol., — 1969. —Vol.59(1). — P. 103–109.

5.        Warmink, J. A. Migratory response of soil bacteria to hyphae of Lyophyllum Karsten in soil microcosms [Text] / J.A. Warmink, J. D. van Elsas // Appl. Environ. Microbiol. — 2009. — P. 1‑38.