ИЗУЧЕНИЕ  ИММУННОЙ  РЕАКЦИИ  СОСНЫ  НА  ЗАРАЖЕНИЕ  ОФИОСТОМОВЫМИ  ГРИБАМИ  С  ПОМОЩЬЮ  ХМС  И  ТГ/ДСК-АНАЛИЗА

Кукина  Татьяна  Петровна

к.  х.  н,  доцент,  с.  н.  с.  НИОХ  СО  РАН,  г.  Новосибирск

E-mail:  kukina@nioch.nsc.ru

Полякова  Галина  Геннадьевна

к.  б.  н.,  с.  н.  с.,  ИЛ  имени  В.  Н.  Сукачева  СО  РАН,  г.  Красноярск

E-mail:  ggpolyakova@mail.ru

Пашенова  Наталья  Вениаминовна

E-mail:  pasnat@ksc.krasn.ru

к.  б.  н.,  доцент,  с.  н.  с.,  ИЛ  имени  В.  Н.  Сукачева  СО  РАН,  г.  Красноярск

  Фролова  Татьяна  Сергеевна

студент  НГУ,  г.  Новосибирск

E-mail:  tanuhost@yandex.ru

  Шундрина  Инна  Казимировна

к.  х.  н,  с.  н.  с.  НИОХ  СО  РАН,  г.  Новосибирск

E-mail:  ishund@nioch.nsc.ru

Сальникова  Ольга  Иосифовна

Инженер  НИОХ  СО  РАН,  г.  Новосибирск

E-mail: 

Система  хвойные-офиостомовые  грибы  является  одним  из  примеров  взаимоотношения  растения-хозяина  и  паразита.  Насекомые-ксилофаги,  переносящие  эти  грибы  на  своей  поверхности,  инфицируют  проводящие  ткани  ствола  при  его  повреждении  [12].  Изучение  механизмов  устойчивости  растений  к  патогенам  требует  решения  таких  взаимосвязанных  проблем,  как  выбор  индуктора  иммунной  реакции  и  маркеров  фитоиммунитета.  Обычно  мицелий  вносят  в  полость,  высеченную  в  живой  коре  (лубе)  ствола.  Параметры  ответа  растения  на  воздействие  мицелия  сравнивают  с  параметрами  реакции  на  контрольное  поранение  луба.  Наши  исследования  направлены  на  проверку  возможности  замены  мицелия  его  экстрактивными  веществами.  Результаты  экспериментов  на  деревьях  и  каллусах  хвойных  свидетельствуют,  что  характеристики  ответа  тканей  хвойных  на  действие  мицелиальных  экстрактов  аналогичны  таковым  при  использовании  живого  мицелия  [2-3,  5-7,  10].  Отмечена  активация  фенольного  метаболизма,  накопление  лигнина,  увеличение  зоны  некротизации  луба  по  сравнению  с  контрольными  некрозами  от  поранения.  Использование  грибных  препаратов  вместо  живого  мицелия  позволяет  исключить  артефакты,  обусловленные  ростом  и  развитием  мицелия:  выделение  развивающимся  мицелием  продуктов  его  метаболизма  в  растительную  ткань  и  поглощение  им  питательных  веществ  растения  [9].  Сравнение  параметров  ответа  луба  на  поранение  и  поранение  в  сочетании  с  воздействием  грибного  экстракта  показало  разную  динамику  характеристик  основного  и  вторичного  метаболизма  в  этих  двух  вариантах  опыта.  Результаты  позволили  сделать  предположение  о  том,  что  свойство  офиостомовых  грибов  поселяться  в  проводящих  тканях  ствола  хвойных  после  занесения  их  в  ткани  растения  насекомыми-ксилофагами  обусловлено  способностью  этих  микромицетов  ингибировать  процессы  раневой  репарации  растения.  Об  этом  свидетельствует  отставание  во  времени  процесса  лигнификации  стенок  ситовидных  клеток  в  зоне  ответа  луба  на  действие  грибного  экстракта  и  активации  ферментов  фенольного  метаболизма  в  каллусах  хвойных  по  сравнению  с  таковыми  в  контрольных  вариантах  [10-11].  При  этом  содержание  и  состав  липофильных  компонентов  при  повреждении  и  заражении  коры  дерева  офиостомовыми  грибами  практически  не  исследовано  [8].

При  анализе  зоны  некроза  луба  Pinus  silvestris,  вызванного  внесением  экстракта  из  мицелия  гриба  Ceratocystis  laricicola  Redfern&Miner,  выявлены  липофильные  соединения,  содержание  которых  существенно  изменилось  после  обработки  растительной  ткани  грибным  препаратом.  Анализ  липофильных  соединений  методом  хроматомасс-спектрометрии  (ХМС)  осуществлялся  в  трех  вариантах  опыта:  №1  –  луб  P.  silvestris,  отобранный  в  начале  опыта  (0  суток);  №2  –  луб,  отобранный  через  21  суток  после  его  поранения  –  высекания  полости  в  живой  коре  до  глубины  древесины;  №3  –  луб,  отобранный  через  21  суток  после  высекания  полости  и  инъецирования  ее  экстрактом  C.  laricicola. 

Предварительные  исследования  показали  увеличение  массы  флоэмы  в  вариантах  2  и  3  по  сравнению  с  1,  что  говорит  о  транспорте  резервных  веществ  к  месту  поранения  в  связи  с  активным  ответом  растительной  ткани  и  синтезом  защитных  соединений.  Увеличение  массы  луба  в  варианте  3  по  сравнению  с  2  косвенно  свидетельствует  о  биологической  активности  экстрактивных  веществ  патогенного  гриба.

Опыт  проводился  на  сырье  сбора  2009  и  2010  года  в  двух  повторностях  на  каждом  образце  сырья.  Воздушно-сухое  сырье  размолото  на  электрической  мельнице  и  просеяно  через  сито  с  отверстиями  размером  2  мм.  Экстракция  проводилась  ступенчато  в  проточном  перколяторе.  Навеска  сырья  загружалась  в  перколятор,  заливалась  порцией  экстрагента,  нагретого  до  50°С,  настаивалась  в  течение  1-1.5  часа,  экстракт  сливался  через  нижний  кран.  Сырьё  заливали  растворителем  с  таким  расчётом,  чтобы  слой  растворителя  над  сырьём  был  0,5-0,7  см.  При  этом  гидромодуль  (соотношение  растворитель:сырьё)  составляет  1,5-2.  Процесс  повторяли  3-4  раза.  При  смене  растворителя  остаток  экстракта  удалялся  из  перколятора  продуванием  через  сырье  воздуха.  Порции  экстракта  выпаривались  на  роторном  испарителе  досуха  для  определения  массового  выхода  экстрактивных  веществ.  Экстракты,  богатые  липофильными  компонентами,  были  получены  путем  применения  метил-трет-бутилового  эфира  (МТБЭ).  Далее  экстракцию  проводили  96%-ным  этанолом.  Средние  выходы  экстрактов  сведены  в  таблицу.  Пробоподготовка  для  ХМС-анализа  включала,  помимо  экстракции,  выделение  фракций  свободных  кислот,  связанных  кислот  и  нейтральных  компонентов,  а  также  метилирование  кислых  фракций  диазометаном.  Хроматомасс-спектры  записаны  на  приборе  Hewlett  Packard  G  1800  A,  состоящем  из  газового  хроматографа  HP  5890  серии  II  и  масс-селективного  детектора  HP  5971.  Колонка  30  м  ´  0,25  мм  ´  0,25  мкм  с  сорбентом  HP-5MS  (5  %  —  дифенил,  95  %  —  диметилсилоксан).  Газ-носитель  —  гелий  (1  мл/мин).  Температура  колонки:  2  мин.  при  50°C,  далее  повышение  температуры  со  скоростью  4°  в  мин.  до  300°C,  30  мин  при  300°C.  Температура  испарителя  280°C,  источника  ионов  170°C.  Такой  режим  анализа  обеспечивает  более  полное  прохождение  анализируемой  смеси  через  колонку  хроматографа  и  как  следствие  обнаружение  компонентов  с  длиной  цепи  более  22  атомов  углерода  и  высокоокисленных  дитерпеноидов  [1].

Методом  хроматомасс-спектрометрии  однозначно  идентифицированы  более  20  алифатических  и  дитерпеновых  кислот  в  свободном  и  связанном  виде,  а  также  ряд  нейтральных  компонентов.  Алифатические  кислоты  представляют  собой  компоненты  с  длиной  цепи  от  14  до  26  углеродных  атомов,  включая  непредельные.  Отмечено,  что  поранение  и  инъецирование  коры  снижает  содержание  свободных  алифатических  кислот  в  8-10  раз,  связанных  в  виде  жиров  и  эфиров  –  в  2-5  раз.  Содержание  стеринов  снижается  в  1.5-2  раза,  причем  нативный  луб  содержит  в  основном  (75  %)  свободные  стерины,  а  в  поврежденном  и  инъецированном  образцах  β-ситостерин  этерифицирован  преимущественно  линолевой  и  олеиновой  кислотами.  Дитерпеновые  соединения  представлены  в  основном  смоляными  кислотами  в  свободном  и  метилированном  виде,  спиртами  и  альдегидами,  ранее  идентифицированными  в  этом  виде  сосны  и  других  хвойных  растениях  [4],  однако  соотношение  их  меняется  при  повреждении  и  инъецировании.  Содержание  альдегидов  наивысшее  в  инъецированной  флоэме,  в  пораненном  лубе  высокий  процент  дитерпеновых  спиртов.  При  поранении  и  инъецировании  флоэмы  растет  содержание  смоляных  кислот  1.5-2  раза,  окисленных  смоляных  –  в  5-11  раз.  Таблица  1  отражает  изменение  в  соотношении  главных  компонентов  исследованных  образцов  флоэмы  сосны  при  повреждении  и  инъецировании.

С  целью  изучения  иммунной  реакции  сравнивали  также  данные  термогравиметрии  (ТГ)  и  дифференциальной  сканирующей  калориметрии  (ДСК)  образцов  экстрактов  флоэмы  ствола  сосны  в  трех  вариантах  опыта.  Результаты  ТГ/ДСК-анализа,  как  и  проведенный  хроматомасс-спектрометрический  анализ  эфироэкстрактивных  липофильных  компонентов  флоэмы,  показали  достоверное  различие  измеренных  показателей  в  вариантах  опыта  1-3.  Нами  получены  диаграммы  как  для  липофильных  экстрактов,  полученных  при  помощи  метил-трет-бутилового  эфира  (МТБЭ),  так  и  для  более  полярных  компонентов,  выделенных  последующей  экстракцией  этанолом.  Измерения  проведены  на  приборе  STA  409  PC  (Netzsch)  в  температурном  интервале  от  20  до  560°  С.  Метод  не  требует  пробоподготовки  и  дериватизации  исследуемой  пробы.  Кривые,  полученные  для  МТБЭ-экстрактов  и  для  этанольных  экстрактов  исследуемых  образцов  луба,  демонстрируют  существенное  отличие  характеристичных  фазовых  переходов  в  каждом  образце.  Таблица  2  иллюстрирует  потерю  массы  в  зависимости  от  температуры  при  нагревании  образцов  от  комнатной  температуры  до  500°C.  Результаты  свидетельствуют  о  возможности  использования  ТГ/ДСК-анализа  для  изучения  механизмов  иммунитета  растений,  в  том  числе,  к  дереворазрушающим  базидиомицетам  и  для  диагностики  состояния  дерева  при  нарушении  целостности  коры.

Полученные  результаты  могут  способствовать  разработке  методик  диагностики  состояния  древостоев  и  получению  противогрибковых  препаратов  на  основе  липофильных  компонентов,  характеризующих  иммунный  ответ  растения  на  фунгальное  заражение.  Оптимизация  этих  методик  позволяет  проверить  модель  создания  растением  "неполноценной"  питательной  среды,  разработанной  для  травянистых  растений  и  подтвердить  принципиальную  возможность  расшифровки  механизмов  взаимодействия  хвойных  растений  и  патогенов  в  природных  условиях  без  риска  распространения  грибной  инфекции  в  насаждении.  Это  дает  возможность  выявлять  изменчивость  механизма  защиты  в  связи  с  действием  экологических  факторов.

Таблица  1.  Параметры  флоэмы  ствола  сосны  в  трех  вариантах  опыта

  *-Содержание  соединений  в  нативной  флоэме  взято  за  100  %. 

  АК  –  алифатические  кислоты,  ДК  –  дитерпеновые  кислоты.

Таблица  2.  ТГ/ДСК-анализ  образцов  флоэмы  сосны.  Потеря  массы,  (%)  при  нагреве  образцов.

Список  литературы:

1.Баяндина  И.И.,  Кукина  Т.П.,  Покровский  Л.М.  Неполярные  компоненты  экстрактов  зверобоя  продырявленного  //  Химия  растительного  сырья.  –  2007.  –  3.  –  С.  39-45.

2.Ветрова  В.П.,  Матренина  Р.М.,  Полякова  Г.Г.,  Пашенова  Н.В.  Метаболиты  патогенных  деревоокрашивающих  микромицетов  как  индукторы  защитных  реакций  хвойных  //  Микология  и  фитопатология.  –  1995.  –  Т.  29.  –  Вып.  2.  –С.  33-38. 

3.Ильинская  Л.И.,  Васюкова  Н.И.,  Озерецковская  О.Л.  Биохимические  аспекты  индуцированной  устойчивости  и  восприимчивости  растений  //  Итоги  науки  и  техники.  Защита  растений.  М.:  ВИНИТИ.  1991.  –  Т.  7.  –  192  с.

4.Пентегова  В.А.,  Дубовенко  Ж.В.,  Ралдугин  В.А.,  Шмидт  Э.Н.  Терпеноиды  хвойных  растений,  Новосибирск:  Наука,  1987.  –  97  с.

5.Поляков  В.И.,  Полякова  Г.Г.,  Пашенова  Н.В.,  Стасова  В.В.  Применение  грибных  метаболитов  для  оценки  состояния  сосновых  древостоев  в  условиях  промышленного  загрязнения  //  Известия  РАН.  Сер.  биол.  –  2005.  –  №4.  –  С.  506-512.

6.Полякова  Г.Г.,  Пашенова  Н.В.,  Поляков  В.И.,  Зражевская  Г.К.  Индуцирование  иммунной  реакции  хвойных  метаболитами  фитопатогенных  грибов  //  Физиология  растений.  –  2008.  –  №4.  –  С.  552-559. 

7.Полякова  Г.Г.,  Пашенова  Н.В.,  Поляков  В.И.,  Стасова  В.В.  Иммунный  метод  изучения  состояния  сосновых  древостоев  //  Иммунопатология,  аллергология,  инфектология.  –  2009.  –  №1.  –  С.  97-98.

8.Полякова  Г.Г.,  Кукина  Т.П.,  Пашенова  Н.В.,  Сальникова  О.И.,  Стасова  В.В.  Применение  мицелиальных  экстрактов  для  изучения  механизмов  устойчивости  хвойных  к  офиостомовым  грибам  //  Иммунопатология,  аллергология,  инфектология.  –  2010.  –  №1.  –  С.  124.

9.Полякова  Г.Г.,  Стасова  В.В.,  Пашенова  Н.В.  Защитная  реакция  флоэмы  ствола  сосны  на  поранение  и  действие  экстракта  из  мицелия  Ceratocystis  laricicola  //  Физиология  растений.  –  2011.  –  №5.  –  C.  702-710. 

10.Шеин  И.В.,  Полякова  Г.Г.,  Зражевская  Г.К.,  Пашенова  Н.В.,  Ветрова  В.П.  Накопление  фенольных  соединений  каллусными  культурами  хвойных  как  реакция  на  грибы  синевы  древесины  //  Физиология  растений.  –  2001.  –  Т.  48.  –№2.  –  С.  251-256. 

11.Шеин  И.В.,  Андреева  О.Н.,  Полякова  Г.Г.,  Зражевская  Г.К.  Изменение  содержания  фенольных  соединений  в  каллусе  сосны  в  ответ  на  элиситацию  Fusarium  разной  степени  патогенности  //  Физиология  растений.  –  2003.  –Т.  50.  –  №  5.  –  С.  710-715.

12.Paine  T.D.,  Raffa  K.F.,  Harrington  T.C.  Interactions  among  scolytid  bark  beetles,  their  associated  fungi  and  live  host  conifers  //  Annu.  Rev.  Entomol.  –  1997.  –  42.  –  P.  179-206.