РОЛЬ НИТРАТ/НИТРИТ РЕДУКТАЗНОЙ И NO-СИНТАЗНОЙ СИСТЕМ ПРИ НЕПОЛНОЙ ИШЕМИИ МОЗГА

ROLE OF NITRATE/NITRITE REDUCTASE AND NO-SYNTHASE SYSTEMS DURING TRANSIENT GLOBAL CEREBRAL ISCHEMIA

Victor Kuzenkov

candidate of Science, Faculty of Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University,

Russia, Moscow

АННОТАЦИЯ

Цель. Исследовали роль нитрат/нитрит-редуктазной системы при ингибировании NO-синтаз (NOS) в условии неполной глобальной ишемии мозга. На модели экспериментального ишемического инсульта, вызванной одновременной двусторонней окклюзией общих сонных арте­рий, изучали влияние неселективного блокатора NOS N^ω-nitro-L-arginine (L-NNA), вводимого в дозе 25 мг/кг, и нитратов — КNO₃, NaNO₃, Mg(NO₃)₂, Ca(NO₃)₂, вводимых в дозах 50 мг/кг. Метод. Крысы Вистар были разделены на 20 опытных групп (n=440) и 4 контрольные группы (n=88). Опытным группам вводили или один из нитратов, или ингибитор NOS L-NNA совместно с одним из нитратов или только один L-NNA. Препараты вводились за 1 ч до ишемии мозга и через 5 с после одновременной двусторонней окклюзии общих сонных артерий. Контрольным крысам вводили 0,9 % NaCl. Результат. Установлено, что неселективный ингибитор NOS L-NNA на фоне неполной глобальной ишемии мозга увеличивает неврологический дефицит и летальность. Нитрат/нитрит-редуктазная система в зависимости от катиона, входящего в состав нитрат/нитрит-редуктаз, при ингибировании NOS-системы в условии неполной глобальной ишемии мозга способна оказать протективное действие. Вывод. Mg(NO₃)₂ обладает наиболее мощным протективным действием на ишемический инсульт даже в условии ингибирования NOS.

ABSTRACT

Background. To reveal a protective role of the nitrite/nitrate reductase system in NO- synthase (NOS) inhibition in ischemic stroke. An effect of the non-selective NOS inhibitor N^ω-nitro-L-arginine (L-NNA) introduced in dose of 25 mg/kg and nitrates (КNO₃, NaNO₃, Mg(NO₃)₂, Ca(NO₃) in doses of 50 mg/kg) on ischemic stroke induced by the occlusion of carotid arteries in an experimental model was studied. Methods. The animals (Wistar rats) were stratified into 20 experimental groups (n=480) and 4 control groups (n=96). One of nitrates or L-NNA along with one of nitrates or L-NNA alone were administered to experimental groups 1h before brain ischemia or 5 s after carotid artery occlusion. 0.9 % NaCl was used in the control rats. Result. L-NNA increases neurological deficit and lethality in brain ischemia. Depending on a cation, the nitrite/nitrate reductase system may play a protective role in the inhibition of NOS-system in brain ischemia. Conclusion. In brain ischemia and NOS inhibition, Mg(NO₃)₂ has the greatest protective effect.

Ключевые слова: нитрат/нитрит-редуктаза, NOS, нитраты, инсульт.

Keywords: nitrate/nitrite reductase system; NOS; LNNA; brain ischemia; neurological impairments.

В научном сообществе до сих пор сохраняется неоднозначное отно­шение к действию нитратов на организм человека, которое за последние полвека менялось диаметрально противоположно. На протяжении тыся­челетий нитраты применялись для лечения различных заболеваний. Так, нитрат калия (KNO₃), известный в средние века как серебряный нитрат или лунный каустик, до конца XIX века применялся как антивоспалительное и мочегонное средство, для лечения бубонной чумы и лихорадки, как успокаивающий агент против конвульсий и для лечения сердечно-сосудистых заболеваний [1]. В середине XX столетия наступила эпоха “нитратофобии”. Нитраты стали считать причиной метгемоглобинимии (особенно у детей) и канцерогенеза. Это привело к очень строгим инструкциям содержания уровня нитратов в пище и питьевой воде. Хотя было известно, что в странах, где в пищу употребляется много овощей и фруктов, содержащих «смертельные» концентрации нитратов, люди отличаются долгожительством [2-3].

В 80-е годы XX века была установлена роль оксида азота (NO) в различных физиологических и патофизиологических процессах. Исследователи определили, что NO синтезируется семейством ферментов NO-синтаз (NOS) и, что он вовлечен во многие патофизиологические процессы, включая инсульт [4]. В зависимости от источника и концентра­ции NO может проявлять как повреждающие, так и протективные свойства. Умеренный синтез NO способен увеличивать кровоток в мозге, ингибировать агрегацию тромбоцитов и адгезию лейкоцитов, что приводит к протективному эффекту на ишемию мозга, а недостаток или избыток NO вызывает повреждения тканей мозга [5].

На протяжении десятков лет считалось, что в клетках млекопи­тающих NO синтезируется исключительно NO-синтазами. Активность этих ферментов сильно варьирует во время патологических состояний, особенно во время ишемического инсульта (ИИ). При этом в организме образуется большое количество нитратов и нитритов, которые раньше считались инертными конечными продуктами окисления NO. Поэтому по уровню этих продуктов в биологических жидкостях судили об активности NOS и интенсивности ишемического процесса в мозге [6]. Применение как селективных, так и неселективных ингибиторов NO‑синтаз для регулирования активности NOS ферментов и выявления роли различных форм NOS показало, что инактивация NOS неселектив­ными ингибиторами увеличивает повреждение мозговой ткани во время ИИ [7-8].

В конце XX столетия взгляд на воздействие нитратов на организм человека снова кардинально изменился. Нитраты стали считать активным терапевтическим участником физиологических процессов. Теперь нитраты считают не конечными продуктами окисления NO, а формой хранения оксида азота [9-10]. Было установлено, что помимо NO-синтазной системы в организме млекопитающих существует мощная нитрат/нитрит редуктазная система, продуцирующая NO как в физио­логических, так и в патологических условиях. К этим ферментам относится многочисленные металлсодержащие нитрат/нитрит редуктазы. Эти энзимы участвуют в трансформации нитратов в NO как в прямом, так и в обратном направлении (NO₃¯ → NO₂¯ → NO → NO₂¯ → NO₃¯). Особенно интенсивно эти трансформации различных форм NO проис­ходят во время снижения кислорода в мозге, например при ИИ [11-12]. Во время ИИ происходит падение напряжения кислорода, который явля­ется субстратом NOS, поэтому уменьшается активность NO-синтазной системы образования NO. Многие ферменты в условии гипоксии меняют направленность своего действия. Так, при гипоксии NOS, дезокси­гемоглобин, энзимы митохондрий и ряд других ферментов выступают в роли нитрит/нитрат-редуктаз [13-14]. Поэтому, в условии гипоксии, когда NOS не способна синтезировать NO, активируется альтернативная нитрат/нитрит редуктазная система защиты организма (вероятно, более древняя система, которая возникла в эпоху зарождения жизни на Земле, когда кислорода или не было, или было очень мало).

Активность разных нитрат/нитрит редуктаз зависит как от уровня кислорода и pH, так и от типа катионов, входящих в состав нитратов. Нитрат редуцирующая активность падает в ряду: K⁺, Na⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Ba²⁺ [15].

Автор считает, что в условии ишемии\гипоксии, когда NO-синтазная система инактивируется, например, во время ИИ, проис­ходит активация более древней нитрат/нитрит редуктазной системы. Возможно, нитрат/нитрит редуктазная система является альтернативной NO-синтазной системе или они дополняют друг друга особенно при патологических состояниях. Эти две системы сосуществуют также в растениях, где они играют важную роль [16-17]. Вероятно, при патологических состояниях особенно в условиях ишемии/гипоксии нитрат/нитрит редуктазная система становится основной формой синтеза NO и более древним источником энергии, поскольку нитратное дыхание возникло на Земле раньше, чем аэробное [18].

В предыдущей работе нами было показано, что в зависимости от типа катиона и концентрации нитратов, а также времени их воздействия на динамику неврологических нарушений, они могут оказывать как протективный, так и повреждающий эффект на ИИ [19]. До настоящего времени считается, что эти эффекты зависят от активности NO-синтазной системы. Поэтому целью данной работы было проверить, может ли нитрат/нитрит редуктазная система проявить протективную роль при ингибировании NO-синтаз в условии неполной глобальной ишемии мозга. Было исследовано влияние нитратов: КNO₃, NaNO₃, Mg(NO₃)₂, Ca(NO₃)₂, как доноров NO, на экспериментальный ишемический инсульт в условии инактивации NO-синтазной системы неспецифическим ингибитором NOS N^ɷ-nitro-L-arginine (LNNA).

Материал и методы

Для создания модели глобальной ишемии мозга применяли одно­моментную двустороннюю перевязку общих сонных артерий. Крысам под эфирным наркозом выделяли и перевязывали общие сонные артерии. Длительность операции составляла не более 10 мин. После эфирного наркоза у крыс быстро восстанавливалось сознание. Крыс помещали в отдельные клетки и полуколичественно оценивали динамику невро­логической симптоматики [20]. Оценивали ограничение подвижности животного, птоз, гиперактивное поведение, насильственные движения (вращения, прыжки, судорожные и вращательные припадки), парезы конечностей, кому и смерть. В соответствии с использованной методикой оценки неврологического дефицита, за 0-3 балла принимали состояние, близкое к нормальному; за 3-6 баллов – среднюю степень ИИ; за 7-24 балла – тяжелую степень ИИ; за 25 баллов – смерть животного. Неврологические нарушения оценивали через каждые 30 мин в течение 8 часов. Для всех животных в группе по каждому промежутку времени усредняли суммарный балл. На основе полученных данных строили графики динамики неврологической симптоматики, отложив по оси ординат баллы, по оси абсцисс – время.

В предварительном эксперименте неселективный ингибитор NOS L-NNA в дозе 25 мг/кг вводили внутрибрюшинно за 1 ч до ишемии мозга и после 5с окклюзии двух сонных артерий. Поскольку разницы между временем введения L-NNA не было выявлено, то в данном исследовании L-NNA вводили за 1 ч до ишемии мозга.

В данном исследовании у всех крыс была произведена окклюзия двух сонных артерий. Было проведено 4 серии экспериментов, в которых было использовано 528 крысы по 132 крысы в каждой серии. В каждой серии эксперимента в зависимости от применяемых нитратов (KNO₃; NaNO₃; Mg(NO₃)₂; Ca(NO₃)₂) животные были разбиты на 6 групп: 5 опытных и 1 контрольную (рис. 1-8).

Животным контрольной группы (1- группа, n=22) внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (0,9% NaCl). Крысам 2-й опытной группы (n=22) вводили ингибитор NOS L-NNA в дозе 25 мг/кг внутри­брюшинно; крысам 3-й опытной группы (n=22) вводили один из нитратов в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до ишемии мозга; крысам 4-й опытной группы (n=22) вводили один из нитратов в дозе 50 мг/кг через 5 с после окклюзии общих сонных артерий; крысам 5-й опытной группы (n=22) вводили один из нитратов в дозе 50 мг/кг и L-NNA в дозе 25 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до ишемии мозга; крысам 6-й опытной группы (n=22) вводили один из нитратов в дозе 50 мг/кг и L-NNA в дозе 25 мг/кг через 5 с после окклюзии общих сонных артерий.

Достоверность различий средних параметров в разных экспери­ментальных группах животных оценивали с помощью критерия Манна-Уитни (U Test) в программе STATISTIKA 6. Для оценки леталь­ности неврологических проявлений применяли критерий Фишера.

Результаты

Рисунок 1. Влияние нитрата калия (КNO₃) и L-NNA, введённых за 1 час до ишемии мозга на течение экспериментального ИИ. 1 – контроль; 2 – L-NNA в дозе 25 мг/кг; 3 – КNO₃ в дозе 50 мг/кг; 4 – КNO₃ + L-NNA. * p<0,05 – достоверность различий между 3-й и 1-й группами; ^# p<0,05 – достоверность различий между 2-й и 1-й группами

Неврологические нарушения в группе, получавшей KNO₃ в дозе 50 мг/кг за 1 час до ишемии мозга, были достоверно выше, чем в контроле (p<0,05) на протяжении 270-480 мин. Неврологический дефицит у крыс, получавших одновременно KNO₃ и L-NNA, в течение 240-330-й мин был достоверно (p<0,05) ниже, чем у крыс, получавших L-NNA в дозе 25 мг/кг (см. рис. 1). Смертность в 3-й опытной группе крыс составила 54,5 % и была выше, чем в контроле – 27,3 %. Смертность во 2-й группе составила 40,9 %, а в 4-й группе – 31,6 %.

Рисунок 2. Влияние нитрата калия (КNO₃) и L-NNA, введённых через 5 с после ишемии мозга на течение экспериментального ИИ. 1 – контроль; 2 – L-NNA в дозе 25 мг/кг; 3 – КNO₃ в дозе 50 мг/кг; 4 – КNO₃ + L-NNA. * p<0,05 – достоверность различий между 3-й и 1-й группами; # p<0,05 – достоверность различий между 2-й и 1-й группами

KNO₃, введенный в дозе 50 мг/кг за 5 с после окклюзии сонных артерий увеличил неврологические нарушения, которые с 330-480 мин по сравнению с контролем были достоверно (p<0,05) выше (см. рис. 2). Неврологический дефицит у крыс, получавших L-NNA в дозе 25 мг/кг, в течение 240-330-й мин был достоверно (p<0,05) выше, чем у крыс, получавших одновременно KNO₃ и L-NNA (см. рис. 2). Смертность в 3-й группе крыс была достоверно (p<0,05) выше, чем в контрольной группе и составила 68,2 % и 27,3 % соответственно. Смертность в группе крыс получавших одновременно KNO₃ и L-NNA была достоверно ниже (p<0,05), чем в группе животных, получавших L-NNA в дозе 25 мг/кг, и составила 31,8% и 40,9% соответственно.

Рисунок 3. Влияние нитрата натрия (NaNO₃) и L-NNA, введённых за 1 час до ишемии мозга на течение экспериментального ИИ. 1 – контроль; 2 – L-NNA в дозе 25 мг/кг; 3 – NaNO₃ в дозе 5 мг/кг; 4 – NaNO₃ + L-NNA. ^# p<0,05 – достоверность различий между 2-й и 1-й группами; *** p<0,001 – достоверность различий между 3-й и 1-й группами; ^{^^^} p<0,001 – достоверность различий между 4-й и 1-й группами. ⁺⁺⁺ p<0,001 – достоверность различий между 3-й и 2-й группами; ^XX p<0,01 – достоверность различий между 4-й и 2-й группами

У крыс, которым вводили NaNO₃ в дозе 50 мг/кг неврологические нарушения на протяжении 270-480 мин были достоверно ниже (p<0,001), чем у контрольной группы и на протяжении 150-480 мин достоверно (p<0,001) ниже, чем у крыс, которые получали L-NNA в дозе 25 мг/кг (см. рис. 3). Неврологический дефицит у крыс, получавших одновременно NaNO₃ в дозе 50 мг/кг и L-NNA в дозе 25 мг/кг, в течение 180-330 мин был достоверно (p<0,001) ниже, чем у животных, которые получали только L-NNA в дозе 25мг/кг (см. рис. 3). В контрольной группе невро­логические нарушения на протяжении 240-330 мин были достоверно (p<0,05) ниже, чем в группе крыс, которые получали L-NNA в дозе 25 мг/кг (см. рис. 3). Неврологический дефицит в контроле на протяжении 330-480 мин был достоверно выше (p<0,05), чем у крыс получавших одновременно NaNO₃ в дозе 50 мг/кг и L-NNA в дозе 25 мг/кг (см. рис. 3). Достоверной разницы по неврологическим нарушениям между 3-й и 4‑й группами на протяжении всего опыта не наблюдалось. Смертность во 2-й группе была достоверно выше (p<0,05), чем в 3-й и 4-й группах крыс и составила 40,9 %, 9,1 % и 13,6 соответственно. Смертность в контроле составила 27,3 %.

Рисунок 4. Влияние нитрата натрия (NaNO₃) и L-NNA, введённых через 5с после ишемии мозга на течение экспериментального ИИ. 1 – контроль; 2 – L-NNA в дозе 25 мг/кг; 3 – NaNO₃ в дозе 5 мг/кг; 4 – NaNO₃ + L-NNA. # p<0,05 – достоверность различий между 2-й и 1-й группами; *** p<0,001 – достоверность различий между 3-й и 1-й группами; ^^^ p<0,001 – достоверность различий между 4-й и 1-й группами. +++ p<0,001 – достоверность различий между 3-й и 2-й группами; XXX p<0,001 – достоверность различий между 4-й и 2-й группами

Неврологические нарушения у крыс, которые получали NaNO₃ в дозе 50 мг/кг в течение 270-480 мин были достоверно ниже (p<0,001), чем у контрольной группы и на протяжении 150-480 мин достоверно (p<0,001) ниже, чем у крыс, которые получали L-NNA в дозе 25 мг/кг (см. рис. 3). Неврологический дефицит у крыс, получавших одно­временно NaNO₃ в дозе 50 мг/кг и L-NNA в дозе 25 мг/кг, в течение 180-480 мин был достоверно (p<0,001) ниже, чем у животных, которые получали только L-NNA в дозе 25 мг/кг (см. рис. 3). В контрольной группе неврологические нарушения на протяжении 240-330 мин были достоверно (p<0,05) ниже, чем в группе крыс, которые получали L-NNA в дозе 25 мг/кг и достоверно выше (p<0,05) на протяжении 330-480 мин, чем у крыс получавших одновременно NaNO₃ в дозе 50 мг/кг и L-NNA в дозе 25 мг/кг (см. рис. 3). Достоверной разницы по неврологическим нарушениям между 3-й и 4-й группами на протяжении всего опыта не наблюдалось. Смертность во 2-й группе была достоверно выше (p<0,05), чем в 3-й и 4-й группах крыс и составила 40,9 %, 9,1 % и 13,6 соответственно. Смертность в контроле составила 27,3 %. Смертность во 2-й группе была достоверно выше (p<0,05), чем в 3-й и 4-й группах крыс и составила 40,9 %, 13,6 % и 13,6 соответственно. Смертность в контроле составила 27,3 %.

Рисунок 5. Влияние нитрата магния (Mg(NO₃)₂) и L-NNA, введённых за 1 час до ишемии мозга на течение экспериментального ИИ. 1 – контроль; 2 – L-NNA в дозе 25 мг/кг; 3 –Mg(NO₃)₂ в дозе 5 мг/кг; 4 – Mg(NO₃)₂ + L-NNA.  ^# p<0,05 – достоверность различий между 2-й и 1-й группами; *** p<0,001 – достоверность различий между 3-й и 1-й группами; ^{^} p<0,05 – достоверность различий между 4-й и 1-й группами. ⁺⁺⁺ p<0,001 – достоверность различий между 3-й и 2-й группами; ^XXX p<0,001 – достоверность различий между 4-й и 2-й группами

Интенсивность нарастания неврологического дефицита в группе, которая получала Mg(NO₃)₂ за 1 час до ишемии в дозе 50 мг/кг на протя­жении 330-480 мин была достоверно (p<0,001) ниже, чем в контрольной группе животных и в течение 120-480 мин, чем во 2-й группе (p<0,001). Неврологические нарушения во 2-й группе на протяжении 120-480 мин были достоверно (p<0,001) выше, чем в 4-й группе и в течение 270-360 мин чем в 1-й группе (см. рис. 5). Неврологический дефицит в контроле на протяжении 420-480 мин был достоверно (p<0,05) выше, чем 4-й группе. Достоверной разницы по неврологическим нарушениям между 3-й и 4-й группами на протяжении всего опыта не наблюдалось. Смертность в контроле составила 27,3 % и была достоверно (p<0,01) выше, чем в 3-й группе (0 %). Смертность во 2-й группе была достоверно выше, чем в 3-й (p<0,001) и 4-й (p<0,01) группах крыс и составила 45,5 %, 0 % и 13,6 соответственно.

Рисунок 6. Влияние нитрата магния (Mg(NO₃)₂) и L-NNA, введённых через 5с после ишемии мозга на течение экспериментального ИИ. 1 – контроль; 2 – L-NNA в дозе 25 мг/кг; 3 – Mg(NO₃)₂ в дозе 5 мг/кг; 4 – Mg(NO₃)₂ + L-NNA. ^# p<0,05 – достоверность различий между 2-й и 1-й группами; *** p<0,001 – достоверность различий между 3-й и 1-й группами; ^{^^^} p<0,001 – достоверность различий между 4-й и 1-й группами. ⁺⁺⁺ p<0,001 – достоверность различий между 3-й и 2-й группами; ^XXX p<0,001 – достоверность различий между 4-й и 2-й группами

У животных, которым вводили Mg(NO₃)₂ в дозе 50 мг/кг через 5 с после окклюзии 2-х сонных артерий, неврологический дефицит на протяжении 180-480 мин был достоверно (p<0,001) менее выражен, чем у контрольной группы крыс и в течение 120-480 мин животных, которым вводили только L-NNA. Неврологические нарушения в 4-й группе на протяжении 120-480 мин были достоверно (p<0,001) менее выражены, чем во 2- группе и на протяжении 270-360 мин, чем в 1-й группе (см. рис. 6). Неврологический дефицит в контроле на протяжении 330-480 мин был достоверно (p<0,001) выше, чем 4-й группе. Достоверной разницы по неврологическим нарушениям между 3-й и 4-й группами на протяжении всего опыта не наблюдалось. Смертность во 2-й группе крыс была достоверно (p<0,001) выше, чем 3-й группе и достоверно (p<0,01) выше 4-й группе и составила 45,5 %, 0 % и 9,1 % соответственно. Смертность в 1-й была достоверно выше, чем 3-й группе и составила 31,8 % и 0 % соответственно.

Рисунок 7. Влияние нитрата кальция (Ca(NO₃)₂) и L-NNA, введённых за 1 час до ишемии мозга на течение экспериментального ИИ. 1 – контроль; 2 – L-NNA в дозе 25 мг/кг; 3 – Ca(NO₃)₂ в дозе 5 мг/кг; 4 – Ca(NO₃)₂ + L-NNA. ^# p<0,05 – достоверность различий между 2-й и 1-й группами; * p<0,05 – достоверность различий между 3-й и 1-й группами

У животных, которым вводили Ca(NO₃)₂ в дозе 50 мг/кг за 1 час до окклюзии 2-х сонных артерий, неврологический дефицит в течение 240-480 мин был достоверно (p<0,05) более выражен, чем у контрольной группы крыс. У крыс, которым вводили L-NNA в дозе 25 мг/кг, невро­логические нарушения на протяжении 240-390 мин были достоверно (p<0,05) более выражены, чем в контроле (см. рис.7). Смертность в 1-й группе составила 27,3 % и была достоверно (p<0,05) ниже, чем во 2-й (50,0 %) и 3-й (63,6 %) группах. Смертность в 4-й группе составила 31,8 %.

Рисунок 8. Влияние нитрата кальция (Ca(NO₃)₂) и L-NNA, введённых через 5с после ишемии мозга на течение экспериментального ИИ. 1 – контроль; 2 – L-NNA в дозе 25 мг/кг; 3 – Ca(NO₃)₂ в дозе 5 мг/кг; 4 – Ca(NO₃)₂ + L-NNA. ^# p<0,05 – достоверность различий между 2-й и 1-й группами; * p<0,05 – достоверность различий между 3-й и 1-й группами

Динамика нарастания неврологических нарушений у крыс, которым вводили Ca(NO₃)₂ в дозе 50мг/кг через 5с после ишемии мозга была более выражена, чем в других группах и на протяжении 180-480 мин была достоверно (p<0,05) выше, чем у контрольной группы крыс. У крыс, которым вводили L-NNA в дозе 25 мг/кг, неврологический дефицит в течение 240-390 мин был достоверно (p<0,05) более выражен, чем в контроле (см. рис. 8). Смертность в 1-й группе составила 27,3 % и была достоверно (p<0,05) ниже, чем во 2-й (50,0 %) и 3-й (63,6 %) группах. Смертность в 4-й группе составила 38,4 %.

Обсуждение

Ишемия мозга, вызванная окклюзией двух сонных артерий, инициирует каскад патобиохимических реакций, вызывая повреждения тканей мозга. Введение неселективных ингибиторов NOS приводит к уменьшению мозгового кровотока, повышению артериального давления, увеличению сопротивления сосудов мозга. Данные изменения в сосу­дистой системе на фоне ишемии/гипоксии, усиливает повреждения клеток мозга, что приводит к увеличению неврологической симпто­матики и гибели животных [7-8]. Данные утверждения согласуются с полученными результатами. Во всех 4-х сериях эксперимента на рисунках 1-8 (кривые 1 и 2) хорошо видно, что кривые № 2, обозна­чающие неврологические нарушения при внутрибрюшинном введении L-NNA в дозе 25 мг/кг, лежат выше кривых № 1 (контроль). Гибель животных во всех сериях опыта, на фоне ишемии мозга и введённого внутрибрюшинно L-NNA в дозе 25мг/кг также выше, чем у контрольных животных. Данные результаты объясняются тем, что во время ишемии мозга неврологическая симптоматика при ингибировании NOS усили­вается.

Известно, что нитраты в организме образуются в результате восстановления NO в цепи трансформации NO → NO₂¯ → NO₃¯ многочисленными нитрат/нитрит редуктазными энзимами. В настоящее время установлено, что в условиях ишемии/гипоксии (например, при ИИ) активируется альтернативный нитрат/нитрит редуктазный путь синтеза NO, поскольку из-за дефицита кислорода работа ферментов NO-синтаз инактивируется [11-13]. Сейчас установлено, что активность различных нитрат/нитрит редуктаз зависит от типа катионов, входящих в состав нитратов [15]. Также известно, что умеренное повышение уровня NO приводит к защитному эффекту, а чрезмерный синтез NO приводит к повреждению тканей мозга и усиливает неврологический дефицит [5].

Данные, полученные в результате эксперимента, согласуются с этими утверждениями. Так, из рис. 3-6 видно, что кривые № 3 (обозначающие неврологические нарушения при внутрибрюшинном введении NaNO₃ или Mg(NO₃)₂, взятых в дозе 50 мг/кг, лежат ниже, чем кривые № 1 (контроль). Такое расположение кривых объясняется тем, что в условии гипоксии мозга активируется нитрат/нитрит редуктазные ферменты. Субстратом этих энзимов являются нитраты, трансформация которых приводят к умеренному образованию NO, который в основном и осуществляет протективную роль нитратов. Также известно, что нитраты могут оказывать свои протективные свойства через NO-независимый механизм вследствие их прямого действия на ключевые липиды и белки [21]. На рис. 3-4 кривые № 3 достоверно (p<0,001) лежат ниже, чем кривые № 1, что объясняется протективным дей­ствием NO на ткани мозга во время ишемии/гипоксии. Способность NaNO₃ снижать неврологические нарушения, воздействуя на ключевые белки и липиды, также вносит свой вклад. В наших предыдущих экспериментах мы также наблюдали сильный протективный эффект на экспериментальный ИИ NaNO₃, взятого в дозе 50 мг/кг [22]. Мощный достоверный (p<0,001) протективный эффект Мg(NO₃)₂ в дозе 50 мг/кг (рис. 5-6, кривые 3) на ишемию мозга, связан не только с умеренным повышением NO, но и с мощным сочетанным действием анионов NO₃¯ и катионов Mg²⁺ [19]. Катионы Mg²⁺ снижают чрезмерный вход Ca²⁺ в клетки, уменьшая эксайтотоксичность, снижают агрегацию тромбоцитов и ингибируют активацию провоспалительных цитокинов, способствуют раннему восстановлению клеточных запасов АТФ [23-24].

На рис.1-2 кривые № 3 достоверно (p<0,05) лежат выше, чем кривые № 1, что можно объяснить чрезмерным синтезом NO, который вызвал повреждающие действие на ткани мозга, что проявилось в увеличении неврологической симптоматики у животных и увеличении их гибели. Ранее было показано, что катионы K⁺ обладают сильной нитрат/нитрит редуцирующей активностью по сравнению с другими катионами. Поэтому введение KNO₃ в дозе 50 мг/кг привело к чрезмерному образованию NO, что оказало отрицательное действие на ишемический мозг. При этом в наших предыдущей работе KNO₃ в дозе 5мг/кг, наоборот, оказал сильный протективный эффект на ИИ за счет умеренного образования NO [19, 25].

Повреждающие эффекты на ИИ Ca(NO₃)₂ в дозе 50мг/кг (рис 7-8, кривые 3) вероятно связаны с действием высокой дозы катионов Ca²⁺ на ткани мозга в условиях ишемии и слабой нитрат/нитрит редуци­рующей активностью ионов Ca²⁺ по сравнению с другими катионами. Смертность у крыс, которые получали Ca(NO₃)₂ в дозе 50 мг/кг также была достоверно (p<0,05) выше по сравнению с контрольными животными.

Результаты, полученные в данной работе указывают на то, что в условии ишемии/гипоксии и ингибировании NO-синтазной системы, активируется альтернативный нитрат/нитрит редуктазный путь син­теза NO, что приводит к уменьшению неврологической симптоматики. Более того, в зависимости от типа катиона, входящего в состав нитрата, нитрат/нитрит редуктазная система способна достоверно оказать протек­тивный эффект (см. рис. 1-8, кривые 4 и 2). На всех рисунках видно, что все кривые №2, обозначающие неврологическую симптоматику при введении L-NNA, лежат выше кривых № 4 (совместное введение одного из нитратов и L-NNA). Это можно объяснить тем, что хотя при ингибировании NO-синтаз происходит усиление неврологического дефи­цита и гибели животных, активация альтернативного нитрат/нитрит редуктазного пути синтеза NO, приводит к протективному эффекту, что наблюдается во всех 4-х сериях эксперимента. Смертность животных, у которых была ингибирована NOS система, также во всех случаях была выше, чем у крыс, у которых была активирована нитрат/нитрит редуктазная система. Сила протективного эффекта зависела от типа катиона, входящего в состав нитратов (КNO₃, NaNO₃, Mg(NO₃)₂, Ca(NO₃)₂). На рис. 3-4 и рис. 5-6 наблюдается достоверный протективный эффект между кривыми №4 и №2. Такое расположение кривых на этих графиках связан, вероятно, не только из-за влияния нитрат/нитрит редуктазной системы, но и из-за прямого влияния NaNO₃ и катионов Mg²⁺ на ишемический мозг (объяснение см. выше).

Заключение

Результаты данной работы позволяют сделать вывод, что существующая в организме мощная нитрат/нитрит редуктазная система во время неполной глобальной ишемии мозга и ингибировании NO-синтазной системы способна оказать протективный эффект. В данном исследовании было показано, что протективное влияние нитрат/нитрит редуктазной системы на развитие неврологических нарушений и смерт­ность животных зависит от типа катиона, входящего в состав нитрата. Вероятно, неудачи, связанные с экспериментальными и медицинскими исследованиями по применению доноров NO и ингибиторов NOS, были связаны с тем, что в этих экспериментах не учитывалось влияние древней нитрат/нитрит редуктазной системы. Особое внимание заслужи­вают данные, полученные в этом эксперименте, которые указывают на то, Mg(NO₃)₂ обладает мощным протективным действием на ишемический инсульт даже в условии ингибирования NO-синтаз. Mg(NO₃)₂ может служить недорогим, доступным и эффективным препаратом для лечения сердечно-сосудистых болезней, особенно на стадии скорой помощи.

Список литературы:

1. Hord N.G., Tang Y., Bryan N.S. Food sources of nitrates and nitrites: the physiologic context for potential health benefits. Am J Clin Nutr // – 2009. Vol. 90. №1. – P.1-10.
2. Lidder S., Webb A.J. Vascular effects of dietary nitrate (as found in green leafy vegetables and beetroot) via the nitrate-nitrite-nitric oxide pathway. Br J Clin Pharmacol // – 2013. Vol. 75. № 3. – P. 677-96.
3. Sobko T., Marcus C., Govoni M., Kamiya S. Dietary nitrate in Japanese traditional foods lowers diastolic blood pressure in healthy volunteers. Nitric Oxide // – 2010. Vol. 22. № 2. – P. 136–140.
4. Pacher P, Beckman JS, Liaudet T L. Nitric Oxide and Peroxynitrite in Health and Disease. Physiological reviews // – 2007. Vol. 87. № 1. – P. 315-424.
5. Pereira C., Ferreira N.R., Rocha B.S., Barbosa R.M., Laranjinha J. The redox interplay between nitrite and nitric oxide: From the gut to the brain. Redox Biol // – 2013. Vol. 1. № 1. – P. 276-84.
6. Calvert J.W., Lefer D.J. Clinical Translation of Nitrite Therapy for Cardiovascular Diseases. Nitric Oxide // – 2010. Vol. 22. № 2. – P. 91–97.
7. Garry PS, Ezra M, Rowland MJ, Westbrook J, Pattinson KT. The role of the nitric oxide pathway in brain injury and its treatment--frombench to bedside. Exp Neurol // – 2015. Vol. 263. – P.235-43.
8. Rochette L., Lorin J., Zeller M., Guilland J.C., Lorgis L., Cottin Y., Vergely C. Nitric oxide synthase inhibition and oxidative stress in cardiovascular diseases: possible therapeutic targets? Pharmacol Ther // – 2013. Vol. 140. №3. – P. 239-57.
9. Godínez-Rubí M., Rojas-Mayorquín A.E., Ortuño-Sahagún D. Nitric oxide donors as neuroprotective agents after an ischemic stroke-related inflammatory reaction. Oxid Med Cell Longev // – 2013. Vol. 2013. P. 297357.
10. Bueno M., Wang J., Mora A.L., Gladwin M.T. Nitrite signaling in pulmonary hypertension: mechanisms of bioactivation, signaling, and therapeutics. Antioxid Redox Signal // – 2013. Vol. 18. P. 14.
11. Lundberg J.O., Weitzberg E. NO synthase independent NO generation in mammals. Biochem. Biophys. Res. Commun // – 2010. Vol. 396. № 1. P. 39–45.
12. Jansson E.A., Huang L., Malkey R., Govoni M., Nihlén C., Olsson A., Stensdotter M., Petersson J., Holm L., Weitzberg E., Lundberg J.O. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nat Chem Biol // – 2008. Vol. 4. № 7. P. 411-7.
13. Madigan M., Zuckerbraun B. Therapeutic Potential of the Nitrite-Generated NO Pathway in Vascular Dysfunction. Front Immunol // – 2013. Vol. 4. P. 174.
14. Calvert J.W., Lefer D.J. Clinical Translation of Nitrite Therapy for Cardiovascular Diseases. Nitric Oxide // – 2010. Vol.22. № 2. P. 91–97.
15. Khramov V.A., Komarova V.I., Temkin E.S. Antibiotics as Inhibitors of Nitrate Reductase of Human Oral Fluid. Stomatologiya // – 2000. Vol. 9. № 2. P. 4-5.
16. Freschi L. Nitric oxide and phytohormone interactions: current status and perspectives, Front Plant Sci // – 2013. Vol. 4. P. 398.
17. del Río L.A., Corpas F.J., Barroso J.B. Nitric oxide and nitric oxide synthase activity in plants. Phytochemistry // – 2004. Vol. 65. № 7. P. 783-92.
18. Ducluzeau AL, Schoepp-Cothenet B, van Lis R, Baymann F, Russell MJ, Nitschke W. The evolution of respiratory O₂/NO reductases: an out-of-the-phylogenetic-box perspective // – 2014. Vol. 11. № 98. P. 20140196.
19. Kuzenkov VS, Krushinskii AL, Reutov VP. Effect of cation type and concentration of nitrates on neurological disorders during experimental cerebral ischemia. Bull Exp Biol Med // – 2013. Vol.155. № 6. P. 748-51.
20. Sarkisov K.Yu., Opits B., Oeme P. Influence of substance P fragment (3–4) on the course of cerebral ischemia in rats with different types of behavior. Byul. Eksp. Biol. Med. // – 1996. Vol. 121. № 4. P. 399–403.
21. Gladwin M.T., Raat N.J.H., Shiva S., Dezfulian C., Hogg N., Kim-Shapiro D.B., Patel R.P. Nitrite as a vascular endocrine nitric oxide reservoir that contributes to hypoxic signaling, cytoprotection, and vasodilation. AJP – Heart // – 2006. Vol. 291. №5. P. 2026-2035.
22. Kuzenkov VS, Krushinskiĭ AL, Reutov VP. The effect of nitrates on the outcome of acute experimental ischemic stroke. Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova // – 2012. Vol. 112. №12 (Pt 2). P. 35-9.
23. Gromova O.A., Torshin I.Yu., Kalachaeva A.G., Kuramshin D.B. Molecular biological basis of neuroprotective effects of magnesium. Zh. Nevrol. Psikhiatr. im. S.S. Korsakova // – 2011. Vol. 111. № 12. P. 90–101.
24. Muir K.W. Magnesium in stroke treatment. Postgrad Med J // – 2002. Vol. 78. № 925. P. 641-645.
25. Kuzenkov V.S., Krushinskii A.L. Protective effect of magnesium nitrate on brain ischemia. Bull Exp Biol Med. // – 2014. Vol. 157. № 6. P. 721-3.