ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ПО ПОЛИМОРФИЗМУ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Введение.

Особенные качества митохондриальной ДНК (мтДНК) позволяют использовать данные о её полиморфизме в филогенетическом анализе, маркировании внутрипородных особенностей животных, находить их связь с хозяйственно-полезными признаками. Для генотипирования по полиморфизму в качестве генетического маркера используется кольцевая молекула мтДНК, размером около 16500 пар нуклеотидов (пн). МтДНК строго наследуется по материнскому типу, имеет высокую скорость накопления мутаций, в клетках наблюдается большое количество копий молекул мтДНК.

Митохондриальный геном имеет предоминантное материнское наследование; мать передаёт мтДНК всем потомкам, дочери передают эту мтДНК следующим генерациям. В связи с этим, индивидуумы внутри вида, происходящие от различных матерей являются генетически изолированными друг от друга в отношении мтДНК.

Если ядерные хромосомы переносятся одной копией через гаметы, то митохондриальные гены имеют сотни-тысячи копий на клетку. В митохондриальном геноме отсутствуют рекомбинации и не возникают рекомбинантные гаплотипы.

Различия ядерного и митохондриального генома:

- в диплоидном ядерном геноме полиморфные варианты распространяются в популяции через спаривания и кроссинговер между генами в процессе мейоза;

- митохондриальный полиморфизм возникает путём клонального отбора тесно связанного генома.

По структурной организации митохондриальный геном очень компактный, не содержит интронов. Д-петля (контрольный регион) – единственный некодирующий участок мтДНК. В нем находятся структуры, регулирующие инициацию, репликацию, транскрипцию мтДНК. В участке кодирования содержится 37 генов, регулирующих реакции энергетического метаболизма. Вариации в структуре мтДНК влияют на уровень энергетического метаболизма, который коррелирует продуктивность (молочность, содержание жира, белка в молоке) и воспроизводительную способность животных.

Кодирующий участок делится на 3 домена:

- правый домен R, содержащий участок начала репликации;

- центральный домен C;

- левый домен L.

Как отмечалось, мтДНК имеет высокую скорость накопления мутаций. Мутационные изменения митохондриального генома примерно в 5–10 раз выше в сравнении с изменениями уникальных последовательностей ядерного генома. Гаплоидность и материнский характер наследования в сочетании с наличием высокополиморфных участков даёт преимущество использования маркирующих характеристик мтДНК для генетической идентификации особей в рамках материнских семейств.

Последовательность секвенированного мтДНК КРС – 16338 пн. Это позволяет определять расположение сайтов узнавания рестриктаз.

Секвенирование вариабельного фрагмента Д-петли мтДНК подтвердило существование двух различных митохондриальных линий в популяциях КРС. Обнаружено 55 уникальных гаплотипов.

Учёными ВНИИплем (Московская область, Лесные Поляны) методом рестриктного полиморфизма мтДНК были определены филогенетические взаимоотношения 13 пород КРС. Обнаружено 16 митотипов европейских пород, включивших 20 полиморфных вариантов [1, с. 148]. В числе других пород проведён рестрикционный анализ мтДНК животных алатауской и симментальской пород, интересующих исследователей Казахстана.

Материалы и методы исследований.

Для проведения рестрикционного анализа необходимы очищенные препараты мтДНК в относительно больших количества (0,5 мкг на одно выщепление). Фрагменты размером 500 пн представляют только 3 % митохондриального генома, не визуализируются в гелях.

Количественный выход митохондрий зависит от структуры органов и тканей. Наибольшее количество мтДНК содержится в печени, почках, селезёнке, сердце. Наиболее богатой митохондриями и удобной для гомогенизации является печень.

Можно использовать убойный, биопсионный, прижизненный (плацента и кровь) материал. Выход мтДНК составляет 3 мкг на 1 г свежей ткани. Из замороженной плаценты – 1 мкг мтДНК на 1 г ткани. Плацента содержит большое количество соединительной ткани и межклеточного вещества. Замораживание и хранение материала уменьшает выход мтДНК в два раза. Эмпирически установлено, что замораживание и хранение тканей в течение 1–7 суток при минус 20 °С, предварительно гомогенизированных в буфере с ЭДТА, не снижает выход мтДНК.

Методы получения препаратов мтДНК:

- метод Лансмана с использованием равновесного ультрацентрифугирования в градиенте хлористого цезия (CsCl);

- фенольно-детергентный метод Пауэлла;

- цетавлоновый метод Нактиниса с очисткой на гидроксиапатите [2, С. 1783].

Каждый метод имеет достоинства и недостатки (таблица 1).

Особое внимание при составлении методик уделяется количественному выходу мтДНК, т.к. анализ малых количеств требует применение методов мечения для визуализации фрагментов рестрикции на электрофоретических пластинах.

Таблица 1.

Методы выделения мтДНК

Спектрофотометрическая оценка качества препаратов мтДНК изложенными методами, показала достаточную степень чистоты (А₂₆₀/А₂₈₀≥1,8; А₂₆₀/А₂₃₀≥2,1). Препараты полностью расщепляются рестрикционными эндонуклеазами.

Для массового анализа наиболее подходит фенольно-детергентный метод Пауэлла, для небольшого количества проб и длительного хранения образцов очистка путём градиентного ультрацентрифугирования. При необходимости дополнительной очистки фракции мтДНК рекомендуется использовать гидроксиапатит и цетавлон. Модификации методов снижают затраты времени и стоимости[1, с. 148].

Сайты рестрикции рестриктаз расположены в кодирующих участках митохондриального генома и в регуляторной области Д-петли.

МтДНК – кольцевая молекула, поэтому число фрагментов равно числу сайтов рестрикции. Для 7 ферментов (BamHI, BglII, PstI, HindIII, EcoRI, PvuII, Kpn I) обнаружены полиморфные сайт рестрикции (таблица 2). Полиморфизм мтДНК может служить базой для оценки роли цитоплазматического фактора в формировании продуктивных характеристик.

Таблица 2.

Характеристика полиморфных рестриктных фрагментов мтДНК крупного рогатого скота

Одновременное сочетание вариантов рестриктного расщепления мтДНК определяет митотип. В мтДНК отсутствуют рекомбинации, поэтому комплексный митотип, учитывающий комбинацию сайтов рестрикции в целом, служит главной характеристикой породы, материнского семейства, отдельной особи.

В таблице 3 приведены митотипы Алатауской и Симментальской пород КРС, распространённых в Казахстане.

По данным рестрикционного анализа мтДНК учёными ВНИИплем эти породы относятся к предоминантному европейскому гаплотипу 2-1-1-1 в порядке рестриктаз BamHI–BglII–EcoRI–HindIII.

Таблица 3.

Митотипы крупного рогатого скота Алатауской и Симментальской пород

Предоминантный европейский митохондриальный гаплотип совпадает с вариантом рестрикции, предсказанный по полной последовательности мтДНК (таблица 4). В тоже время Алатауская и Симментальская породы КРС имеют свои оригинальные образцы расщепления мтДНК.

Наряду с выявлением межпородных особенностей, метод ПДРФ мтДНК выявляет межпородную гетерогенность.

Результаты анализа показывают идентичность характера расщепления мтДНК помесных и чистопородных животных и согласуются с материнским типом наследования митохондриального генома. Сходство митотипов исходных чистопородных и помесных животных подчёркивает сохранение интактной материнской основы при межпородных скрещиваниях в ряду поколений. При любых значения степеней кровности характер энергетического метаболизма у полученных животных определяется особенностями митохондриального генома, унаследованного от матери [1, с. 148].

Таблица 4.

Позиции сайтов узнавания рестриктаз в мтДНК крупного рогатого скота

Генетическое сходство определяется по количеству сходных фрагментов в образцах рестрикции. Оценка генетического сходства определятся по формуле M. Nei

где:

F – генетическое сходство;

N_x и N_y – число рестриктных фрагментов в организме X и ;

N_xy – число одинаковых фрагментов у 2-х организмов.

Для оценки генетических дистанций решения задач популяционной генетики необходимо увеличение числа исследуемых животных. Проблему в потребности больших количествах ткани (5–10 г ткани или 400–500 мл крови на анализ) и трудоёмкость процедуры выделения мтДНК для прямой оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) можно решить, используя метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Перед ПДРФ с помощью ПЦР можно амплифицировать фрагмент тотальной ДНК (смесь ядерного и митохондриального геномов), избежав длительную и рутиною процедуру выделения мтДНК. ПЦР с чистыми препаратами мтДНК применять только в качестве контроля.

Для выделения ДНК из крови необходимо обратить внимание на очистку пробы от гемоглобина. При отмывке гемоглобина необходимо сохранить целостность клеточной лейкоцитарной мембраны и цитоплазмы, чтобы не повредить митохондрии. Для этого проводят кратковременный (не более 10 сек.) гипотонический шок, при котором клетка освобождается от гемоглобина и не нарушается лейкоцитарная мембрана. Качество лейкоцитов можно рассмотреть под микроскопом после окрашивания препарата по Романовскому–Гимзе. Наблюдается, что эритроциты разрушаются, а лейкоциты при этом сохраняют целостность клеточной мембраны и цитоплазмы.

При центрифугировании 14000 об/мин повышается выход мтДНК за счёт тромбоцитов и цитоплазмы других клеточных компонентов крови.

Для ПЦР требуется сужение района поиска вариаций до достаточно коротких для амплификации последовательностей ДНК. Наиболее оптимальная область поиска – гипервариабельный регулирующий район Д-петли. Как отмечалось, интерес исследователей к этой области мтДНК обусловлен высокой скоростью накопления мутаций, что даёт возможность поиска специфических маркеров материнских линий мтДНК, исследования происхождения и дифференциации популяций животных.

Праймеры общей длиной 1140 пн, фланкирующие фрагмент нуклеотидной последовательности Д-петли мтДНК крупного рогатого скота (КРС), расположены с 15601 по 404 нуклеотид.

При ПЦР ДНК инкубируется при 3-х температурах, которые соответствуют 3-м циклам амплификации (х 30–35):

- денатурация при 93 °С, 3 мин;

- отжиг при 55 °С–57 °С; при снижении температуры вероятен негомологичный отжиг, при повышении – снижается выход конечного продукта;

- синтез (достройка) при 72 °С–75 °С – оптимальных для действия Tag-полимеразы [3, С. 176–190].

Субстрат для амплификации – фрагмент Д-петли в составе чистого препарата мтДНК или тотальной ДНК. Количество матрицы – важный фактор для ПЦР. При использовании в качестве матрицы мтДНК требуется менее 50 нг субстрата, оптимально – 20 нг. При использовании тотальной ДНК требуется 100 нг матрицы, оптимально – 50 нг. Нужно учесть, что при  использовании верхних границ концентраций матрицы, при ПЦР могут образовываться неспецифические соединения.

Таблица 5

Сайты рестрикции на участке Д-петли мтДНК крупного рогатого скота

В Д-петле мтДНК КРС ферменты AluI, BamHI, BstXI, Eco471, PstI, узнающие последовательности ДНК длиной 6 нуклеотидов, имели один сайт узнавания на участке 15600–404 нуклеотид мтДНК. Ферменты Hind III, Eco RI не имели участков узнавания на данном фрагменте. Рестриктазы, узнающие последовательности ДНК длиной 4 нуклеотида, имели от двух (TaqI) до семи (RsaI) участков узнавания последовательности на амплифицированном полиморфном фрагменте мтДНК (таблица 5).

При расщеплении амлификатов, источником которых являлись пробы тотальной ДНК, выделенной из крови, кожи, плаценты, чистые препараты мтДНК, получены идентичные результаты рестрикции.

При использовании мелкощепящих эндонуклеаз (видят короткие 4-х нуклеотидные последовательности в мтДНК), не все фрагменты визуализируются при электрофоретическом разделении, т.к. их длины превышают разрешающую способность электрофоретического режима. Число, размер таких фрагментов определяются теоретически при анализе последовательности ДНК.

Результаты собственных исследований.

1 Выделена тотальная ДНК из крови КРС симментальской, красной-степной пород казахстанской селекции:

- 5 мл крови, консервированной гепарином или 50мМ ЭДТА, процентрифугировали 10 мин при 2000 об/мин;

- фракцию лейкоцитов (белесоватый промежуточный слой) собрали и перенесли в пробирку с 8–8,5 мл 0,1 мМ ЭДТА при перемешивании;

- через 10 сек. восстановили изотоничность добавлением 1 мл 1х SSC; эритроциты разрушились, лейкоциты сохранили целостность клеточной мембраны и цитоплазму;

- лейкоциты, тромбоциты, ядра, митохондрии осадили центрифугированием при 14 000 об/мин в течение 20 мин;

- слили супернатант, осадок пропипетировали в 1х STE, повторили центрифугирование;

- осадок ресуспендировали в 350–400 мкл 1х SSC, добавили 60–70 мкл        10 % SDS до конечной концентрации 1 %, протеиназу до конечной концентрации 200 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при 37 °С;

- добавили 4–10 мкл РНКазы до конечной концентрации 100 мкл и инкубировали 1 час при 37 °С;

- ДНК выделили фенол-хлороформной экстракцией, осадили охлаждённым (минус 20 °С) 95 % этанолом, промыли 70 % этанолом [1, с. 148].

2 Определена концентрация и нативность выделенной ДНК спектрофотометрической и электрофоретической оценкой.

При спектрофотометрической оценке качество и концентрацию полученных препаратов ДНК оценивали по спектральным характеристикам. Исследованные пробы достаточной степени чистоты препарата ДНК, соблюдены соотношения: А260/А280 ≥ 2,0; А260/А230≥1,8.

При электрофоретической оценке качество и концентрацию ДНК оценивали в 1 % агарозном геле. Аликвоты проб ДНК смешивали с буфером нанесения, содержащим 0,5 % бромфенолового синего в соотношении 5:1 по объёму, нанесли в лунки геля, провели электрофорез в трис-боратном буфере (18 мМ Трис HCl, pH 8,5; 18 мМ борной кислоты, 0,4 мМ ЭДТА) при 40 В в течение 2 часов.

ДНК визуализировали на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете по флуоресценции бромистого этидия. Концентрацию ДНК оценивали по яркости свечения в геле в сравнении с известной концентрацией маркерной ДНК. Об отсутствии деградации (нативности) ДНК свидетельствовало отсутствие шлейфа. Наблюдались примеси РНК в виде пяте в низкомолекулярной зоне.

Заключение.

При полиморфном генотипирования сельскохозяйственных животных Казахстана в качестве генетического маркера можно использовать мтДНК в целях реализации программы по оценке генофонда, создания животных новых генотипов, генетического мониторинга в популяциях. Методы анализа ДНК, предложенный учёными ВНИИплем (Московская область, Лесные Поляны), способствуют дальнейшей реализации программы по сохранению генофонда на международном уровне, использованию существующих банков данных по геному сельскохозяйственных животных.

Список литературы:

1. Калашникова Л. А. ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных. – Московская область, Лесные Поляны : ВНИИплем. – 1999. – 148 с.
2. Нактинис В. И., Малеева Н. Е., Санько В. Ф., Мирзабеков А. Д // Два простых метода выделения ДНК из различных источников с применением цетавлона // Биохимия. – 1977. – Т. 42 – Вып. 10. – С. 1783.
3. Саики, Гиденестен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция. – Анализ генома. Методы. – Москва : Мир.– 1990. – С. 176–190.