СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗА–ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗА В КРОВИ БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ

STATE OF GLUTATHIONE REDUCTASE-GLUTATHIONE PEROXIDASE SYSTEM IN THE BLOOD IN PATIENTS WITH ACUTE LEUKEMIA

Ludmila Gavriliuc

doctor of medical science, Professor

Moldova, Chisinau

Maria Robu

doctor of medical science, Assoc. Professor

Moldova, Chisinau

Svyatoslav Tereschenko

student of the 6 Cours of General Medicine Department, N.Testemitanu State University of Medicine and Pharmacy,

Moldova, Chisinau

АННОТАЦИЯ

Исследовано состояние ферментной редокс-системы глутатиона, включающей глутатионредуктазу (ГР) и глутатионпероксидазу (ГП) в плазме, лейкоцитах и эритроцитах периферической крови 20 здоровых и 17 больных (28-47 лет) острым лимфобластным лейкозом до начала курса терапии. Удельные активности ГР и ГП в плазме и лейкоцитах крови больных были ниже активности энзимов здоровых. В эритроцитах, наоборот, у больных удельные активности энзимов были значительно повышены, ГР (142,6%) и ГП (155,7%). Результаты определения активности энзимов и корреляционного анализа Спирмена свидетельствовали о дисбалансе антиоксидантной системы защиты у больных лейкозом.

ABSTRACT

The state of the enzyme redox system of glutathione, including glutathione reductase (GR) and glutathione peroxidase (GP) in plasma, leukocytes and erythrocytes of peripheral blood of 20 healthy and 17 patients (28-47 years) with acute lymphoblastic leukemia before the start of therapy was investigated. Specific activities of GR and GP in the plasma and white blood cells of patients were lower than the activity of healthy enzymes. In erythrocytes, on the contrary, the specific activity of enzymes in patients was significantly increased, GR (142.6%) and GP (155.7%). The results of the determination of enzyme activity and the correlation analysis of Spearman indicated an imbalance of the antioxidant defense system in the patients with leukemia.

Ключевые слова: глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, острый лейкоз, кровь.

Keywords: glutathione reductase, glutathione peroxidase, acute leukemia, blood.

Острый лейкоз — это онкологическое заболевание, первично возникающее в костном мозге в результате мутации стволовой клетки крови [8]. Следствием мутации является утрата мутировавшей клетки способности к дифференцировке в зрелые клетки крови, результатом чего является появление клона бластных клеток.

При хроническом окислительном стрессе, сопровождающем онкопатологии, повышается количество «кислород-реактивных продуктов» (reactive oxygen species, ROS), активируются процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран, нарушаются многие метаболические процессы [2, с. 200-6].

Биоантиоксидант-глутатион и его ферментная редокс-система играют важную роль в процессах пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток. Глутатион и глутатионзависимые энзимы участвуют во многих внутриклеточных процессах [5, с.1058-1060]. Внутриклеточное изменение состояния ферментной редокс-системы глутатиона может определять чувствительность опухолевых клеток к лекарственным препаратам, применяемым в курсе химиотерапии [4, с. 217-223]. Глутатион и глутатионзависимые энзимы, глутатионредуктаза и глутатионпероксидаза, выполняют важную роль в интегративной системе организма, способствуя клеточной адаптации к окислительному стрессу [1, с.4926-4930; 3, с. 218-222]. Этот ответ координирует антиоксидант, который был найден в промоторах многих генов, в ответ на индукцию окислительным и химическим стрессом [5, с. 143-155; 12, с. 133-140]. Активация гена вовлекает антиоксиданты в процессы защиты клеток, находящихся под влиянием многих агентов, предупреждающих их трансформацию и развитие опухоли [6, с. 142-157].

Принимая во внимание важную роль глутатионзависимых энзимов в процессе опухолевого роста, было решено провести исследование их активности у пациентов с острым лимфобластным лейкозом.

Цель исследования: провести сравнительный анализ состояния ферментной редокс-системы глутатиона, включающей глутатионредуктазу и глутатионпероксидазу, в крови здоровых людей и больных острым лимфобластным лейкозом.

Материал и методы исследования

Объектом исследования были 17 больных острым лимфобластным лейкозом, возрастом 28-47 лет, поступивших для прохождения курса лечения в Отделении гематологии и онкологии Онкологического НИИ Молдовы (Кишинёв). Все исследования были проведены до начала курса химиотерапии. Материалом для исследования была периферическая кровь больных лейкозом и здоровых людей (контрольная группа, 20 человек). Лейкоциты из периферической крови получали путём центрифугирования в двухступенчатом градиенте плотности фиколл-уротраста по методу Boyum A. [11, с. 9-14] с использованием силиконированной посуды. Эритроциты отбирали со дна пробирок, дважды отмывали физиологическим раствором (NaCl – 0,85%, pH 7,4). Лизаты клеток получали инкубацией в течение 30 минут с 0,1% раствором Тритон Х-100 (конечная концентрация) и центрифугировали в течение 15 минут при 5 000 оборотов/мин.

Активности энзимов определяли спектрофотометрически (“Humalyzer 2000”, DE). Активность глутатионредуктазы (ГР) определяли по методу Horn H.  [7, с. 877-879], глутатионпероксидазы (ГП) – по методу Paglia D., Valentine W. [9, с. 159-162]. Содержание общего белка определяли по методу Watanabe N. [10, с. 1552-1554] Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя пакет программ “Microstat” (Microsoft 2007, USA). Коэффициенты ранговой корреляции рассчитывали по методу Спирмена.

Результаты и обсуждение

Результаты исследования активности глутатионзависимых энзимов, ГР и ГП, в плазме, лейкоцитах и эритроцитах периферической крови в относительных единицах (%) по отношению к контролю (100%) демонстрирует рисунок 1.

Глутатионредуктаза (ГР). Удельная активность ГР, представленная в международных единицах активности на г белка (МЕ/г) в плазме крови здоровых людей была равной 0,315 МЕ/г белка, в лейкоцитах – 2,44 МЕ/г белка, а в эритроцитах 12,30 МЕ/г гемоглобина. В плазме крови больных лейкозом удельная активность ГР соответствовала 0,266 МЕ/г белка (84,2%), в лейкоцитах – 2,26 МЕ/г белка (92,5%), в эритроцитах – 17,55 МЕ/ г гемоглобина (142,6%; р<0,01).

Рисунок 1. Активность ГР и ГП в крови больных ОЛЛ (здоровые – 100%)

Глутатионпероксидаза (ГП). Удельная активность ГП в плазме крови здоровых людей была равной 6,29 МЕ/г белка, в лейкоцитах – 18,23 МЕ/г белка, а в эритроцитах – 79,45 МЕ/г гемоглобина. В плазме крови больных лейкозом удельная активность ГП была равной 4,847 МЕ/г белка (77%; р<0,05), в лейкоцитах – 13,70 МЕ/г белка (75,1%; р<0,01), в эритроцитах активность была повышенной, составляя 123.74 МЕ/г гемоглобина (155,7%; р<0,001).

Нетрудно заметить, что активности ГР и ГП в плазме и лейкоцитах периферической крови больных лейкозом ниже, чем их активности в плазме и лейкоцитах здоровых людей. В эритроцитах больных лейкозом, наоборот, активность обоих энзимов была повышенной, что может свидетельствовать об усилении процессов перекисеобразования и интоксикации. Повышенный уровень активности ГП в эритроцитах больных лейкозом до начала терапии также наблюдали Devi G. и соавт. [3, c.54-58], сделав вывод, что это можно рассматривать, как защитный адаптационный эффект эритроцитов от ПОЛ.

Кроме определения активности ГР и ГП были рассмотрены их взаимоотношения в лейкоцитах здоровых и больных лейкозом, используя корреляционный анализ Спирмена. Полученные результаты анализа представлены в таблице.

Таблица.

Корреляционные взаимоотношения между ГР и ГП в лейкоцитах больных лейкозом

Результаты поиска корреляционных взаимоотношений между величинами активности ГР и ГП в лейкоцитах здоровых людей показали наличие прямой корреляционной взаимосвязи, что свидетельствует о тесной функциональной связи энзимов. В лейкоцитах больных лейкозом эта связь была нарушена, что свидетельствует о дисбалансе их антиоксидантной системы защиты. Таким образом, вариабельность величин активностей антиокислительных глутатионзависимых энзимов, ГР и ГП, дисбаланс их функциональной взаимосвязи отражают энзимо-функциональные перестройки не только злокачественных клеток, но и других клеток (эритроцитов) периферической крови больных острым лимфобластным лейкозом.  

Список литературы:

1. Arai M., Imai H., Koumura T. Mitochondrial phospholipid hydroperoxide: glutathione peroxidase plays a major role in preventing oxidative injury to cells. // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. N8. P. 4924-4933.
2.  Aruoma O.I. Free radicals, oxidative stress, and antioxidants in human health and disease.// J. Am. Oil Chem. Soc. 1998. Vol. 75. P. 199-212.
3. Devi G.S., Prasad M.H., Saraswathi I. Free radicals antioxidant enzymes and lipid peroxidation in different types of leukemias.// Clin. Chim. Acta. 2000. Vol. 293. №1-2. P. 53-62.
4.  Erden M., Bor N.M. Changes in reduced glutathione, glutathione reductase, and glutathione peroxidase after radiation.// Biochem. Med. 1984. Vol. 31. N2. P. 217-227.
5.  Filomeni G., Rotilio G., Ciriolo M.R. Cell signaling and the glutathione redox system.// Biochem. Pharmacol. 2002. Vol. 64. P. 1057-1064.
6. Hayes J.D., Ellis E.M., Neal C.E. Cellular response to cancer chemopreventive agents: contribution of the antioxidant responsive elements to the adaptive response to oxidative and chemical stress. In: Downes C.P. et al., eds. Cellular responses to stress biochemical society symposium, 64, London: Portland Press, 1999, P. 141-168.
7. Horn H.D. Glutathione reductase. In: Bergmeyer, H.-U., ed. Methods of enzymatic analysis. New York: Academic Press, 1963, P. 875-879.
8. Jaffe E.S., Harris N.L., Vardiman J.W., Campo E., Arber D.A. Hematopathology (1^st ed), Elsevier Saunders, 2011.
9. Paglia D.E., Valentine W.N. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase.// J. Lab. Clin. Med. 1967. Vol. 70. P. 158-169.
10.  Watanabe N., Kamei S., Ohkuto A. Urinary protein as measured with a pyrogallol red-molybdate complex: Manually and in a Hitachi 726 automated analyzer. //Clin. Chem. 1986. Vol. 32. P. 1551-1554.
11.  Бейум А.М. Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика. (пер. с англ.), М: Мир, 1980.- С. 9-19.
12.  Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-регуляция клеточных функций. //Биохимия (М). 2007.-Том 72.- №2.- С. 132-145.