ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ И БИОХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА СОРТОВ СМОРОДИНЫ ЧЕРНОЙ ИЗ КОЛЛЕКЦИИ ФГБНУ ФНЦ САДОВОДСТВА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ

 «Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов».

АННОТАЦИЯ

Цель. Оценка генетического разнообразия и биохимического состава 12 новых высокопродуктивных сортов смородины черной из коллекции ФГБНУ ФНЦ Садоводства с помощью современных методов анализа для дальнейшего использования в практической селекции, защиты правовых и коммерческих интересов учреждения-оригинатора и авторов сортов. Методы. Оценка генетического разнообразия проводилась с помощью молекулярно-генетического метода анализа микросателлитных маркеров. Для оценки биохимического состава смородины черной применялись методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, титрования, перманганатный и рефрактометрический методы. Результаты. Проведенные исследования позволили определить уникальные составы аллелей микросателлитных локусов 12 сортов смородины черной из коллекции ФГБНУ ФНЦ Садоводства, определить уникальные генотипы, провести класстерный анализ и сформировать единое консенсусное древо (дендрограмму). По результатам исследования биохимического состава 12 сортов смородины черной были выделены сорта, имеющие высокий уровень содержания полезных веществ. Заключение. В настоящее время в ФГБНУ ФНЦ Садоводства продолжается работа по паспотизации 12 новых высокопродуктивных сортов смородины черной из коллекции ФГБНУ ФНЦ Садоводства. Для этого были получены 12 генетических профелей сортов смородины ченой: Бармалей, Брянский Агат, Дебрянск, Миф, Чародей, Гамаюн, Стрелец, Вера, Кудесник, Фаворит, Каскад, Подарок Ветеранам. По результатам секвенирования были выделены 5 уникальных составов аллелей с помочью микросателлитных маркеров g2-G12, e3-B02, g1-E03, e1-001, g1-M07 в сортах Бармалей, Брянский Агат, Дебрянск, Чародей, Подарок Ветеранам. По результатам оценки биохимического состава были выделены сорта Дебрянск, Брянский Агат, Стрелец, Вера, Фаворит, Гамаюн, Кудесник, Бармалей, Миф, Подарок Ветеранам, которые обладают наиболее полезными и ценными признаками для использования в практической селекции.

ABSTRACT

Purpose. Assessment of genetic diversity and biochemical composition of 12 new highly productive black currants varieties from the collection of the Federal State Budgetary Organizanization «Federal Horticultural Center for Breeding, Agrotechnology and Nursery» (FSBSO ARHCBAN) using modern analysis methods for further use in practical selection, protection of legal and commercial interests of the originator institution and authors of varieties. Methods. Assessment of genetic diversity was performed using the molecular genetic, method of microsatellite marker analysis. To assess the biochemical composition, methods of high-performance liquid chromatography, titration, permanganate and were used refractometric methods. Results. The conducted studies made it possible to determine the unique compositions of alleles of microsatellite sequences of 12 black currant varieties from the collection of the FSBSO ARHCBAN, determine unique genotypes, conduct a classter analysis and form a single consensus tree (dendrogram). According to the results of the study of the biochemical composition of 12 varieties of black currants, were identified varieties with a high level of beneficial substances. Conclusion. Currently, work continues at the FSBSO ARHCBAN to passport 12 new highly productive black currants varieties from the collection of the FSBSO ARHCBAN. For this, 12 genetic profels of currant varieties of the black Barmaley, Bryanskiy Agat, Debryansk, Mif, Charodey, Gamaun, Strelec, Vera, Kudesnik, Favorit, Kaskad, Podarok Veteranam were obtained. According to the results of sequencing, 5 unique compositions of alleles with the help of microsatellite markers g2-G12, e3-B02, g1-E03, e1-001, g1-M07 grades of black currants Barmaley, Bryanskiy Agat, Debryansk, Charodey, Podarok Veteranam, which can be used in practical selection, were identified. According to the results of the assessment of the biochemical composition, the varieties Debryansk, Bryanskiy Agat, Strelec, Vera, Favorit, Kudesnik, Barmaley, Mif, Podarok Veteranam, were identified, which have the most useful and valuable traits for use in practical breeding.

Ключевые слова: селекция, ДНК, смородина черная, ПЦР, SSR-маркеры, биохимический состав.

Keywords: selection, DNA, black currant, PCR, SSR markers, biochemical composition.

Введение

Молекулярная селекция растений, генетические модификации позволяют создавать принципиально новые сорта для решения проблем продовольственной безопасности, повышения уровня жизни и здоровья населения. ДНК-технологии сегодня имеют огромное значение в ускорении селекционного процесса, охране авторских прав, защите потребителей от фальсифицированной продукции растениеводства [1, 2, 3].

Смородина черная (Ribes nigrum L.) – одна из основных ягодных культур в России и ряде зарубежных стран. Ценность ягод смородины черной обусловлена богатым биохимическим составом и, прежде всего, высоким содержанием биологически активных веществ [4]. Смородина черная значительно превосходит большинство плодовых и ягодных культур по содержанию в плодах аскорбиновой кислоты и фенольных соединений, представляет экономический интерес за счет неприхотливости, урожайности и возможности механизировать большинство агротехнических мероприятий, включая уборку урожая. [5, 6, 7].

Появление большого количества новых сортов, возрастаюшие требования к их качественным показателям, делают необходимым решение проблем генотипирования и паспортизации многих сельскохозяйственных культур, в том числе черной смородины [8].

Федеральный научный селекционно-технологический центр садоводства и питомниководства (ФГБНУ ФНЦ Садоводства) оригинатор и патентообладатель ряда высокопродуктивных сортов смородины черной, которые на протяжнии десятилетий являются основными в ягодоводстве ряда регионов России. Новые сорта, созданные на Кокинском опорном пункте ФГБНУ ФНЦ Садоводства в Брянской области за последние годы, способны не только превзойти существующий сортимент по показателям продуктивности и качества плодов, но и показывают высокую устойчивостью в полевых условиях к патогенам и абиотическим стрессорам, являются крупноплодными и высоко технологичными [9, 10].

В настоящее время селекция смородины черной направлена на создание продуктивных, стабильно плодоносящих сортов с улучшенным биохимическим составом ягод, с устойчивостью к различным вирусным и бактериальным болезням, а также к насекомым вредителям [11].

Изучение и оценка генетического разнообразия сортов, биохимического состава плодов смородины черной позволяеть не только провести их идентификацию и паспортизацию, но и установить родственные связи между сортами для выделения источников и доноров хозяйственно-ценных признаков, а также защитить коммерческие и правовые интересы авторов и оригинаторов сортов. Для решения этих вопросов в 2021 году в ФГБНУ ФНЦ Садоводства впервые была проведена комплесная оценка генетического разнообразия и биохимического состава 12 сортов смородины черной собственной селекции с помощью ряда методов исследований, позволяющих не только идентифицировать генотипы, но и получить их разностороннюю оценку для оптимального использования в практической селекции на качество плодов.

Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследований были свежие листья и плоды 12 сортов черной смородины селекции Кокинского опорного пункта ФГБНУ ФНЦ Садоводства (Бармалей, Брянский Агат, Дебрянск, Миф, Чародей, Гамаюн, Стрелец, Вера, Кудесник, Фаворит, Каскад, Подарок Ветеранам). Исследования проведены в Лаборатории репродуктивной биотехнологии ФГБНУ ФНЦ Садоводства и в Научно-производственной компании Синтол. Для выделения ДНК из листьев смородины черной был использован метод ЦТАБ с помощью набора реагентов «Сорб-ГМО-Б» НПО «Синтол» с модификациями [12]. Для оценки генетического разнообразия смородины черной были подобраны семь пар праймеров для ПЦР анализа микросателитных локусов: g1-k04, g1-M07, e1-001, g2-G12, e3-B02, g1-E03, g1-B02. Праймеры были синтезированы в компании «Евроген» и помечены специфическими флуоресцентными метками для возможности использовать мультиплексную ПЦР с 4 и 3 парами праймеров в одной реакции [13]. Состав реакционной смеси (конечный объем 15 мкл) был следующий: 1 × ПЦР буферный раствор, 0,3 ед. Taq полимеразы, 200 мкМ нуклеотидов, 10–30 нг ДНК. Реакцию ПЦР проводили по следующей программе: 1 цикл продолжительностью 4 мин при 94 ℃^о; 35 циклов, включающих: 30 с при 94℃, 45 с при 50-52 ℃ (температура отжига подбиралась к каждому праймеру индивидуально), 45 с при 72 ℃; заключительная элонгация – 5 мин при 72 ℃. С помощью ПЦР анализа были получены фрагменты микросателитных локусов и секвенировованы методом Сэнгера. Для оценки биохимического состава в плодах смородины черной определяли содержание: антоцианов, триглицеридов, каротиноидов, аскорбиновой кислоты, пектинов, сухих растворимых веществ, суммы сахаров. Определение антоцианов, триглицеридов и каротиноидов проводили с помощью метода ВЭЖХ [14], аскорбиновой кислоты по ГОСТ [15], определение пектинов методом титрования, сухих растворимых веществ рефрактометрическим методом, суммы сахаров перманганатным методом по ГОСТ [16].

Результаты и обсуждение

Оценка генетического разнообразия и биохимического состава 12 сортов смородины черной проводилась с 2021 по 2022 год. В 2021 году была проведена оценка биохимического состава 12 сортов смородины черной на семь показателей (определение сухих растворимых веществ, сумма сахаров, витамин С, содержание антоцианов, каратиноидов, триглицеридов, сумма пектинов). По результатам оценки биохимического состава ягод смородины черной были выделены сорта Дебрянск, Брянский Агат, Стрелец, Вера, Фаворит, Гамаюн, Кудесник, Бармалей, Миф, Подарок Ветеранам, имеющие высокий уровень содержания полезных веществ и может быть использованно в практической селекции (таблица 1).

Таблица 1.

Оценка биохимического состава 12 сортов смородины черной из коллекции ФГБУ ФНЦ Садоводства

 - выделены сорта смородины черной, имеющие высокий уровень содержания полезных веществ.

В результате оценки генетического разнообразия 12 сортов смородины черной с помощью семи SSR - маркеров на каждый сорт смородины был получен свой уникальный генетический профиль, были выявлены пять уникальных генотипов (таблица 2). Минимальное количество уникальных генотипов – один, выявлен с помощью микросателлитного маркера e3-B02. Среднее значение количества уникальных генотипов составило 3,1. Среднее значение дискриминационной силы маркера (PD) для 7 маркеров составило 0,5, что говорит о высокой диагностической ценности отобранных маркеров.

Таблица 2.

Генотипы 12 сортов смородины черной из коллекции ФГБУ ФНЦ Садоводства по семи микросателлитным локусам

На основе рассчитанных генетических дистанций между 12 сортами смородины черной был проведен кластерный анализ и сформировано единое консенсусное дерево. Анализ полученного в результате кластеризации иерхического дендрита позволяет выделить две основные группы (кластера). В кластер I отнесены сорта Брянский агат, Стрелец, Гамаюн, Вера, Бармалей, Миф, в то время как кластер II включает сорта Подарок Ветеранам, Каскад, Дебрянск, Кудесник, Фаварит, Чарадей (рисунок 1).

Рисунок 1. Дендрограмма степени генетического сходства, полученная по семи микросателлитным локусам 12 сортов смородины черной из коллекции ФГБУ ФНЦ Садоводства

По результатам анализа генетических профелей 12 сортов смородины черной количество редких аллелей составило от 1 до 3. Для отдельных аллелей частота встречаемости была очень высокой. Так, локус g1-k04 (аллель длиной 300 п. н.) выявлен у 6 сортов, локус e1-001 (аллель длиной 144 п. н.) у 7 сортов, локус e1-001 (аллель длиной 160 п. н.) у 6 сортов, локус g3-b02 (аллель длиной 163 п. н.) у 6 сортов, локус g1-E03 (аллель длиной 241 п. н.) выявлен у 6 сортов. В результате оценки уникальности генотипов было установлено что, наиболее уникальные генотипы содержат локусы g1-k04 (20%), g1-M07 (21%), e1-001 (25%).

Заключение

В настоящее время в ФГБНУ ФНЦ Садоводства продолжается работа по паспотизации 12 новых высокопродуктивных сортов смородины черной из коллекции ФГБНУ ФНЦ Садоводства. Для этого были получены 12 уникальных генетических профелей сортов Бармалей, Брянский Агат, Дебрянск, Миф, Чародей, Гамаюн, Стрелец, Вера, Кудесник, Фаворит, Каскад, Подарок Ветеранам и проведена оценка их биохимического состав. По результатам оценки генетического разнообразия были выделены 5 уникальных составов аллелей с помочью микросателлитных маркеров g2-G12, e3-B02, g1-E03, e1-001, g1-M07 в сортах Бармалей, Брянский Агат, Дебрянск, Чародей, Подарок Ветеранам, которые могут быть использованы в практической селекции. Полученые результаты оценки генетического разнообразия позволили сформировать набор из семи SSR - маркеров для проведения идентификации генотипов смородины черной на молекулярном уровне. По содержанию антоцианов, триглицеридов, каротиноидов, аскорбиновой кислоты, пектинов, суммы сахаров и сухих растворимых веществ наиболее ценными источниками являются сорта: Дебрянск, Брянский Агат, Стрелец, Вера, Фаворит, Гамаюн, Кудесник, Бармалей, Миф, Подарок Ветеранам.

Список литературы:

1. Lunkenbein S, Salentijn EMJ, Coiner HA, Boone MJ, Krens FA, Schwab W. Up- and down-regulation of Fragaria × ananassa O-methyltransferase: impacts on furanone and phenyl propa noid metab olism. J Exp Bot 2006b;57:2445–53;
2. Sidorova T, Mikhailov R, Pushin A, Miroshnichenko D, Dolgov S. Agrobacterium-Mediated Transformation of Russian Commercial Plum cv. “Startovaya” (Prunus domestica L.) With Virus-Derived Hairpin RNA Construct Confers Durable Resistance to PPV Infection in Mature Plants Front Plant Sci (2019), 10 286. DOI:10.3389/fpls.2019.00286;
3. Sidorova T, Pushin A, Miroshnichenko D, Dolgov S. Generation of transgenic rootstock plum ((Prunus pumila L. × P. salicina Lindl.) × (P. cerasifera Ehrh.)) using hairpin-RNA construct for resistance to the plum pox virus. Agronomy (Basel) (2018), 8 (1) . DOI:10.3390/agronomy8010002;
4. Левгерова Н.С., Салина Е.С., Сидорова И.А., Оценка новых сортов смородины черной селекции ВНИИСПК по содержанию БАВ в продуктах переработки // Современные тенденции устойчивого развития ягодоводства россии (смородина, крыжовник), Воронеж, 2018. – С. 187-193;
5. Сазонов Ф. Ф., Селекция и сортоизучение смородины черной на Кокинском опорном пункте ФГБНУ ВСТИСП // 244-267;
6. Сазонов Ф. Ф., Достижения в селекции и основные направления совершенствования сортимента смородины чёрной в ФНЦ Садоводства // Плодоводство и ягодоводство России, Москва, 2021. – С. 18-28;
7. Сазонов Ф. Ф., Сортовые различия смородины чёрной по биохимическому составу плодов // Аграрная наука - сельскому хозяйству, Барнаул, 2017. – С. 271-273;
8. Сазонова И.Д., Оценка новых сортов смородины черной Кокинского опорного пункта ВСТИСП для технической переработки // Аграрная наука в условиях модернизации и инновационного развития, Иваново, 2017. - 175-180;
9. Сазонов Ф. Ф., Биологический потенциал смородины черной и возможности его реализации в новых сортах // Селекция и сорторазведение садовых культур, Жилина, 2015. – С. 167-170;
10.  Сазонов Ф. Ф., Лущеко В.П., Достижения и перспективы селекции чёрной смородины на Кокинском опорном пункте ФГБНУ ВСТИСП // Сборник научных трудов Государственного Никитского ботанического сада, Ялта, 2019. – С. 217-227;
11. Макаркина М.А., Янчук Т.В., Князев С.Д., Оценка и отбор исходного материала для селекции смородины черной на улучшение химического состава ягод // Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур, Жилина, 2017. – С. 168;
12. Инструкция к набору для выделения ДНК «Набор реагентов для выделения ДНК «Сорб-ГМО-Б»», ЗАО «Синтол». https://www.syntol.ru/bitrix/docs/GM-503%20SORB-GMO-B%20instrukciya.pdf;
13. Межнина В.А., Урбанович А.Ю. Изучение генетической изменчивости представителей Ribes L., выращиваемых в Беларуси, The EuroBiotech Journal, №1 (2), - 2017. - С.184-187. DOI: https://doi.org/10.24190/ISSN2564-615X/2017/02.13;
14. Рудаков О.Б. и др., Хроматографические определение натуральных и искуственных каротиноидов в пищевых продуктах // ВЕСТНИК ВГУ №1. – 2004. –С. 78-84;
15. ГОСТ 24556-89. Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витамина С. URL: http://docs.cntd.ru/document/1200022765;
16. ГОСТ 8756.13-87 Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения сахаров. URL: http://docs.cntd.ru/document/1200022639.