ИЗУЧЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ МЕТАНОЛДЕГИДРОГЕНАЗЫ ОБЛИГАТНОЙ МЕТИЛОТРОФНОЙ БАКТЕРИИ METHYLOPHYLUS QUAYLEI

STUDYING THE SUBSTRATE SPECIFICITY OF METHANOL DEHYDROGENASE OF THE OBLIGATE METHYLOTROPHIC BACTERIUM METHYLOPHYLUS QUAYLEI

Anna Pshenichnikova

Ph.D. chem. Sciences, Associate Professor of the Department of Biotechnology and Industrial Pharmacy, Associate Professor, MIREA - Russian Technological University,

Russia, Moscow

АННОТАЦИЯ

Фермент метилотрофных бактерий метанолдегидрогеназа (МДГ) участвует в ассимиляции метанола и на практике используется для получения биосенсоров, гены МДГ включают в конструкции для получения промышленных продуцентов, способных к росту на метаноле, доступном непищевом субстрате. Получены белковые экстракты из клеток облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei и изучено влияние природы субстрата на активность фермента МДГ. Показано, что МДГ M. quaylei обладает широкой субстратной специфичностью.

ABSTRACT

Methanol dehydrogenase (MDH), the enzyme of methylotrophic bacteria, is involved in the assimilation of methanol and is used in practice to obtain biosensors; MDH genes are included in designs to obtain industrial producers capable of growing on available methanol. Protein extracts were obtained from the cells of the obligate methylotrophic bacterium Methylophilus quaylei. The influence of the nature of the substrate on the activity of the MDH enzyme was studied. M. quaylei MDH has been shown to have broad substrate specificity.

Ключевые слова: метилотрофные бактерии, метанолдегидрогеназа, субстратная специфичность.

Keywords: methylotrophic bacteria, methanol dehydrogenase, substrate specificity.

Развитие биотехнологической промышленности, в частности, производство рекомбинантных белков и других важнейших продуктов в настоящее время происходит по двум основным направлениям – традиционно - с использованием природных нативных продуцентов, прежде всего бактерий и грибов, а также рекомбинантных организмов с изменениями в геноме, которые увеличивают возможности природных штаммов. В качестве первого бактериального продуцента эукариотического белка инсулина был использован рекомбинантный штамм Escherichia coli, трансформированный плазмидой, содержащей ген проинсулина [1]. Также изменение генома продуцента направлено на создание конструкций, определяющих условия культивирования, природу используемых субстратов и последующее выделение продуктов. Платформы на основе грамотрицательных и грамположительных бактерий и дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris для генетических рекомбинаций широко распространены в биотехнологии благодаря быстрому росту и генетической стабильности этих продуцентов. Вместе с этим практически все продуценты для биосинтеза экономически важных продуктов, таких как рекомбинантные белки, аминокислоты, антибиотики используют углеводные субстраты – глюкозу, сахарозу, гидролизаты крахмала, мелассу - фактически пищевое сырье. Поскольку себестоимость продуктов в биотехнологии, главным образом, определяется стоимостью субстрата – источника углерода, использование более доступных субстратов определяет экономичность процесса.

Использование вместо углеводов в качестве источника углерода и энергии метанола – доступного, относительно недорогого непищевого сырья, которое получают из возобновляемых источников, представляет экономический и экологический интерес. К росту на метаноле способны природные аэробные грамположительные и грамотрицательные бактерии и дрожжи разных таксономических групп [2,3]. Однако они не отличаются способностью к биосинтезу необходимых веществ, высокой скоростью роста и продуктивностью. Новым и перспективным направлением в биотехнологии является создание неприродных метилотрофных организмов, так называемых синтетических метилотрофов, способных в качестве единственного источника углерода и энергии использовать метанол [3-5]. Эта способность достигается перенесением генов, отвечающих за утилизацию метанола, в геном продуцентов важнейших продуктов, например, таких, как Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum и Saccharomyces cerevisiae. Эти синтетические метилотрофные микроорганизмы могут расти на метаноле и производить целевые вещества с высокой добавленной стоимостью [4,5].

Первый этап утилизации метанола обеспечивается ферментом метанолдегидрогеназой (МДГ) c. У грамположительных бактерий эту функцию выполняет никотинадениндинуклеотид (НАД), а у метилотрофных дрожжей метанол окисляется ферментом метанолоксидазой, использующей в качестве акцептора электронов кислород [6]. НАД-зависимая МДГ окисляет метанол с низкой скоростью и характеризуется низким сродством к метанолу, что требует использования высоких концентраций метанола, трудно достижимых в промышленных условиях [6]. Выбор типа метанолдегидрогеназы в синтетической метилотрофии все более склоняется к использованию ПХХ-зависимой МДГ, несмотря на то, что кофактор ПХХ не синтезируется промышленными штаммами бактерий в отличие от НАД.

Помимо получения синтетических метилотрофов метанолдегидрогеназы имеют перспективы использования в качестве биологических элементов в биосенсорах для определения метанола. Был сконструирован амперометрический биосенсор с высоким сродством к метанолу и линейной областью для концентрации метанола 0.002–0.1 mM на основе ПХХ-зависимой метанолдегидрогеназы бактерии Methylorubrum extorquens [7]. Таким образом, поиск и изучение новых продуцентов метанолдегидрогеназ открывает новые возможности для разработки биоэлектрокаталитических систем.

Целью настоящей работы было определение активности фермента метанолдегидрогеназы в клеточных экстрактах облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei .

Объектом исследования явилась аэробная облигатная метилотрофная бактерия Methylophilus quaylei (ВКМ B-2338), характеризующаяся наличием ПХХ-зависимой метанолдегидрогеназы [8]. Бактерии культивировали в синтетической среде с 1%об. метанола [9] при 30^оС при перемешивании 170 об/мин до стационарной фазы роста 36 ч и затем центрифугированием (8000g, 30 мин) отделяли биомассу. Для получения клеточных экстрактов биомассу ресуспендировали в 0,05 М фосфатном буфере pH 7,0 и дезинтегрировали ультразвуком (3 раза по 1 мин при 0^оС). Клеточный дебрис отделяли центрифугированием (8000g, 30 мин). В супернатанте (клеточном экстракте) определяли активность МДГ, как описано в [10]. Реакцию проводили в спектрофотометрической кювете при 25^оС, реакционная смесь (3мл) содержала 0.1м Tris-HCl буфер pH 9.0; 5.33мМ субстрата (CH₃OH или других использованных спиртов); 0.11мМ феназинметосульфата (ФМС); 43.33мкМ 2,6-дихлорфенолиндофенолята (ДХФИФ); 1мМ KCN; 15мМ NH₄Cl; 100 – 200 мкл клеточного экстракта, содержащего 32-40 мкг белка. За начало реакции принимали время добавления клеточного экстракта. Фиксировали значения оптической плотности при 600 нм от времени (каждые 10 с). Молярный коэффициент экстинкции ДХФИФ принимали равным 21,8 см^-1·ммоль^-1 при рН 9,0. Активность МДГ выражали в мкМ восстановленного ДХФИФ в мин на мг белка, рассчитывали по трем независимым опытам. Содержание белка определяли по методу Лоури, используя в качестве стандарта раствор бычьего сывороточного альбумина.

В бактериальных клетках ПХХ-зависимая МДГ передает электроны конечному электронному акцептору цитохрому c. In vitro МДГ проявляет активность в присутствии первого электронного акцептора феназинметосульфата и активатора - ионов аммония [10]. Контроль за ходом реакции осуществляли по изменению окраски конечного акцептора 2,6‑дихлорфенолиндофенолята.

На первом этапе исследовали влияние концентрации ФМС на активность МДГ. Концентрацию ФМС варьировали от 0,05 до 2 мМ и в качестве рабочей была выбрана концентрацию 0,11 мМ, при которой была обнаружена наибольшая активность фермента. Также было выбрано значение рН 9,0, соответствующее максимуму активности МДГ. Была определена активность МДГ в клеточных экстрактах для ряда первичных спиртов и их производных, а также для многоатомных спиртов (Рисунок 1).

Рисунок 1. Влияние природы субстрата на активность метанолдегидрогеназы M. quaylei

Как следует из диаграммы, представленной на Рисунке 1, наибольшая активность МДГ M. quaylei проявляет в реакции окисления метанола, этанола, н-бутанола и формальдегида, что характерно для МДГ бактерий рода Methylophilus [11]. Активность МДГ в клеточных экстрактах для метанола на 50-80% выше, чем для других спиртов. Интересно, но некоторая активность была зафиксирована для 2-метилпропанола-1 (изобутанола), этиленгликоля и некоторых аминопроизводных пропанола и бутанола, но эти данные требуют проверки в опытах с очищенным ферментом.

Список литературы:

1. Goeddel D.V., Kleid D.G., Bolivar F. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin // Proc Natl Acad Sci. – 1979. – V. 76, №1. – P. 106–110.
2. Chistoserdova L., Kalyuzhnaya M.G., Lidstrom M.E. The expanding world of methylotrophic metabolism // Annu Rev Microbiol. 2009. – V. 63. - Р. 477-499.
3. Whitaker W. B., Sandoval N. R., Bennett R. K. Synthetic methylotrophy: engineering the production of biofuels and chemicals based on the biology of aerobic methanol utilization // Curr Opin Biotechnol. - 2015. – V. 33. - P. 165–175.
4. Zhang M., Yuan X.J., Zhang C. Bioconversion of methanol into value-added chemicals in native and synthetic methylotrophs // Curr Issues Mol Biol. – 2019. - V. 33, №1 – P. 225–236.
5. Gan Y., Meng X., Gao C., Song W. Metabolic engineering strategies for microbial utilization of methanol // Eng Microbiol, 2023. - V. 3, №3: - 100081.
6. Krüsemann J.L., Rainaldi V., Cotton C.A. The cofactor challenge in synthetic methylotrophy: bioengineering and industrial applications // Curr Opin Biotechnol. 2023. - V. 82. - 102953.
7. Karaseva T., Fedorov D., Baklagina S., Ponamoreva O. Isolation and Characterization of Homologically Expressed Methanol Dehydrogenase from Methylorubrum extorquens AM1 for the Development of Bioelectrocatalytical Systems // Int J Mol Sci.- 2022. - V. 23. - 10337.
8. Doronina, N., Ivanova, E., Trotsenko, Y., Pshenichnikova А. Methylophilus quaylei sp. nov., a new aerobic obligately methylotrophic bacterium // Syst Appl Microbiol – 2005. – V. 28, №4. - P. 303–309.
9. Пшеничникова А.Б., Нево А.Н.С., Волкова Е.В. Влияние дейтерирования на активность метанолдегидрогеназы Methylophilus sp. B-7741 // Прикладная биохимия и микробиология. – 2004. – Т. 40, № 1. – С. 24–27.
10. Anthony C., Zatman L.J. The microbial oxidation of methanol. Purification and properties of the alcohol dehydrogenase of Pseudomonas sp. M27 // Biochem J. - 1967. - V. 104. P. 953–959.
11. Ghosh R., Quayle J.R. Purification and properties of the methanol dehydrogenase from Methylophilus methylotrophus // Biochem J. – 1981. – V. 199, №1 – P. в245-250.