РЕЗИСТЕНТНОСТЬ СМЕШАННЫХ БИОПЛЕНОК МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ METHYLOPHYLUS QUAYLEI И METHYLORUBRUM EXTORQUENS К АМПИЦИЛЛИНУ

RESISTANCE OF MIXED BIOFILM METHYLOTROPHIC BACTERIA METHYLOPHYLUS QUAYLEI AND METHYLORUBRUM EXTORQUENS TO AMPICILLIN

Anna Pshenichnikova

Candidate of Science, Assistant professor of Department of Biotechnology and Industrial Pharmacy, MIREA - Russian Technological University,

Russia, Moscow

Ekaterina Mitina

Graduate student Department of Biotechnology and Industrial Pharmacy, MIREA - Russian Technological University,

Russia, Moscow

АННОТАЦИЯ

Бактериальные биопленки, состоящие из клеток и межклеточного полимерного матрикса, формируются чаще всего на твердых поверхностях и обладают повышенной резистентностью к антибиотикам. Это является причиной хронических инфекций, лечение которых осложняется образованием смешанных биопленок, состоящих из консорциумов возбудителей. В настоящей работе изучено влияние состава двувидовых биопленок метилотрофных бактерий на резистентность к антибиотику пенициллину. Обнаружено, что выживаемость чувствительного к ампициллину штамма Methylophilus quaylei повышалась в составе биопленки со штаммом Methylorubrum extorquens.

ABSTRACT

Bacterial biofilms, consisting of cells and an intercellular polymeric matrix, are most often formed on hard surfaces and have an increased resistance to antibiotics. This is the cause of chronic infections, the treatment of which is complicated by the formation of mixed biofilms consisting of consortia of pathogens. The present paper examined the effect of the composition of bi-species biofilms of methylotrophic bacteria on antibiotic resistance to penicillin. Survival of the ampicillin-sensitive strain Methylophilus quaylei was found to be increased in the biofilm formulation with the strain Methylorubrum extorquens.

Ключевые слова: метилотрофные бактерии; состав смешанных биопленок; резистентность к антибиотикам, розовоокрашенные метилотрофные бактерии.

Keywords: methylotrophic bacteria; composition of mixed biofilms; antibiotic resistance; pink-colored methylotrophic bacteria.

Причиной хронических инфекций часто становятся биопленки патогенов – сообщества бактерий и других микроорганизмов, погруженных в матрикс, продуцируемый самими клетками, и прикрепленные к поверхности. В составе биопленки клетки приобретают дополнительную устойчивость к действию биоцидных факторов, в том числе, к антибиотикам. Однако в естественных условиях в формировании биопленки принимают участие множество микроорганизмов, связанных сложными экологическими взаимодействиями, которые могут усиливать устойчивость биопленок к антибиотикам [1,2]. Смешанные биопленки встречаются повсеместно, и процессы межвидового взаимодействия участвуют в формировании природных сообществ микроорганизмов и реакциях этих сообществ на стрессы окружающей среды.

Цель настоящей работы заключалась в получении и исследовании двувидовых биопленок метилотрофных бактерий — факультативной розовоокрашенной Methylorubrum extorquens (ВКПМ B‑13995) и облигатной Methylophilus quaylei (ВКМ B‑2338). Данный консорциум может служить моделью смешанных биопленок, имеющих общий источник углерода метанол и различимых микроскопически и по морфологии колоний. Биопленки, включающие метилотрофные бактерии, встречаются на поверхностях растений, в системах кондиционирования воздуха, во влажных помещениях.

Двувидовые культуры Methylorubrum extorquens и Methylophilus quaylei получали, смешивая чистые культуры в соотношениях, рассчитанных по экспериментальным зависимостям содержания колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) от оптической плотности культур. Полученную смесь использовали как инокулят. Биопленки культивировали на полипропиленовых купонах размерами 20×20×0,1 мм в минеральной среде с 0,5 % метанола при 28⁰С и 60 об./мин в течение 24 часов [3]. В случае культивирования с антибиотиком его добавляли в виде водного раствора вместе с инокулятом. Число жизнеспособных клеток в биопленке определяли, десорбируя клетки с купона на смесителе Vortex и высеивая полученную суспензию на плотную среду после серии десятикратных разведений. Число жизнеспособных клеток в планктонной фазе также определяли на плотной питательной среде.

В ходе работы получали биопленки чистых культур Methylorubrum extorquens и Methylophilus quaylei и их смесей без антибиотика и в присутствии ампициллина в концентрации 5×10^-3 мг/мл. Антибиотик и его концентрацию выбирали таким образом, чтобы оба компонента консорциума росли с близкими скоростями. Облигатная метилотрофная бактерия Methylophilus quaylei в отсутствие ампициллина обладала более высокими ростовыми характеристиками, но имела значительно меньшую резистентность к ампициллину. Инокулят смешанных культур составляли с равным соотношением КОЕ обоих штаммов (1:1) или с избытком Methylophilus quaylei (1:2).

В чистых культурах без антибиотика бактерии Methylophilus quaylei более интенсивно образовывали биопленку и быстрее росли в планктоне, чем Methylorubrum extorquens (таблица 1).

Таблица 1.

Влияние условий культивирования на планктонный рост и образование биопленок Methylorubrum extorquens и Methylophilus quaylei

С ампициллином выживаемость Methylophilus quaylei, рассчитанная как отношение числа КОЕ в присутствии антибиотика к числу КОЕ в чистой культуре без антибиотика, составляла 0,07% в биопленке, в планктонной культуре рост полностью подавлялся (рисунок 1). Для Methylorubrum extorquens выживаемость была выше и в биопленках, и в планктоне.

В составе смешанных биопленок без ампициллина бактерии Methylophilus quaylei преобладали и росли, как и в моновидовой пленке; Methylorubrum extorquens в присутствии другого штамма образовывали биопленку хуже, чем в чистой культуре. Аналогичная ситуация наблюдалась и в планктонной культуре. При добавлении антибиотика рост Methylophilus quaylei значительно снижался, однако его выживаемость по сравнению с моновидовой культурой увеличивалась в 8 раз в случае соотношения Methylorubrum extorquens:Methylophilus quaylei — 1:2, причем данный эффект обнаружился только в биопленке, но не в планктонной культуре. Для культуры с соотношением двух штаммов 1:1 увеличения резистентности не обнаружено. Methylorubrum extorquens, которые без антибиотика вытеснялись другим штаммом, в присутствии ампициллина образовывали биопленку и росли в планктоне лучше; данный эффект был более выражен при равном начальном соотношении штаммов в инокуляте.

Рисунок 1. Выживаемость Methylophilus quaylei (а) и Methylorubrum extorquens (b) в биопленках и планктоне в присутствии 5×10^-3 мг/мл ампициллина относительно моновидовых культур без антибиотика

Таким образом, при биопленочном росте Methylophilus quaylei в смешанной культуре с более резистентным к ампициллину Methylorubrum extorquens выживаемость первого зависит от соотношения видов в смешанной культуре и повышается при преобладании в биопленке Methylophilus quaylei. В планктонной культуре повышения выживаемости не наблюдается. В смешанных культурах без антибиотика Methylophilus quaylei вытесняет Methylorubrum extorquens из биопленок и планктонной культуры. Однако при добавлении ампициллина, селективно ингибирующего Methylophilus quaylei, бактерии Methylorubrum extorquens растут в планктоне и образуют биопленку более активно.

Список литературы:

1. Orazi G., O’Toole G. A. «It takes a village»: mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms // J Bacteriol – 2019. – Vol. 202. – №. 1. – P. e00530-19.
2. Elias S., Banin E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors // FEMS microbiol. reviews. – 2012. – Vol. 36. – №. 5. – P. 990-1004.
3. Mohamed А.М.H.A., Pshenichnikova A.B., Shvets V.I. Sodium oleate increases ampicillin sensitivity in Methylophilus quaylei biofilms on teflon and polypropylene // Current Pharmaceutical Biotech. – 2019. – Vol. 20. – №. 3. – P. 261-270.