РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОК HEPG2

DEVELOPMENT OF A MODEL OF NONALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE USING HEPG2 CELLS

Elena Shcherbakova

Intern of Laboratory of Microbiology, Master Student, Department of Molecular Biotechnology, Saint Petersburg State Institute of Technology,

Russia, Saint Petersburg

Tatyana Sall

Junior Researcher, Laboratory of Microbiology, State Research  Institute of Highly Pure Biopreparations, FMBA of the Russian Federation,

Russia, Saint Petersburg

Elena Demyanova

Deputy Head of Laboratory, PhD, Laboratory of Microbiology, State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, FMBA of the Russian Federation,

Russia, Saint Petersburg

Авторы выражают благодарность советнику директора по науке, доктору биологических наук Вахитову Тимуру Яшэровичу за помощь в формировании идеи исследования и обсуждении полученных результатов.

Работа выполнена на базе ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России.

АННОТАЦИЯ

В статье описано создание модели стеатоза печени на клетках HepG2. Клетки культивировали в присутствии пальмитиновой и олеиновой кислот, что приводило к избыточному накоплению липидов. Была проведена количественная оценка содержания нейтральных липидов и триглицеридов в клетках.

ABSTRACT

The article describes the development of a model of liver steatosis in HepG2 cells. Cells were cultured in the presence of palmitic and of oleic acids, which led to an excessive accumulation of lipids. The content of neutral lipids and of triglycerides in the cells was assessed quantitatively.

Ключевые слова: стеатоз печени; НАЖБП; клетки HepG2; триглицериды.

Keywords: liver steatosis; NAFLD; HepG2 cells; triglycerides.

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) – хроническое заболевание, характеризующееся чрезмерным накоплением жира в виде триглицеридов (ТГ) в гепатоцитах. Распространенность НАЖБП в мире варьирует от 6,3 до 33%. При проведении исследования в Российской Федерации (DIREG 2) выявляемость НАЖБП составила 37,3% среди 50 тыс. участников на период 2013-2015 гг. [1].

Диетические привычки, экологические и генетические факторы могут привести к развитию НАЖБП [2]. Начальной стадией заболе­вания является стеатоз, который, при дальнейшем накоплении ТГ на фоне воспаления, переходит в стеатогепатит (НАСГ). Избыточный синтез провоспалительных цитокинов приводит к апоптозу гепатоцитов и развитию фиброза [6].

Важным фактором, способствующим прогрессированию НАЖБП, является дисбиоз кишечной микробиоты. Печень и кишечник анато­мически связаны через воротную систему печени, поэтому продукты кишечной микробиоты (липополисахариды (LPS), метаболиты, включая эндогенный этанол) могут существенно влиять на печеночную пато­логию [7]. LPS могут проникать в кровеносное русло, а затем в печень через воротную вену, где происходит активация клеток Купфера путем воздействия на TLR, в результате чего увеличивается продукция провоспалительных цитокинов [5]. Изменение состава микробиоты приводит к нарушению синтеза микробных метаболитов. К наиболее изученным в настоящее время метаболитам, вовлеченным во взаимо­действие хозяин-микробиота, относятся: короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК), образующиеся в ходе ферментации бактериями пищевых волокон; желчные кислоты, продуцируемые в печени и трансфор­мируемые кишечной микробиотой перед повторным воздействием на хозяина; продукты метаболизма триптофана.

Культура клеток HepG2 представляет собой иммортализованную клеточную линию, состоящую из клеток карциномы печени человека, полученных из ткани печени 15-летнего мужчины европеоидной расы с хорошо дифференцированной гепатоцеллюлярной карциномой. Они имеют морфологию эпителия при выращивании на твердой поверхности и при определенных условиях культивирования. Хорошо исследованы функциональные характеристики клеток HepG2. Они синтезируют и секретируют белки плазмы, осуществляют метаболизм холестерина, ТГ, метаболизм и транспорт липопротеинов, синтез желчных кислот, синтез гликогена и трансдукцию инсулинового сигнала [3].

Целью работы являлось создание модели стеатоза на клетках человеческой гепатокарциномы HepG2 с целью количественной оценки накопления нейтральных липидов и ТГ при НАЖБП.

Материалы и методы. Для создания модели стеатоза печени использовали: клеточную культуру человеческой гепатокарциномы (HepG2); 1% бычий сывороточный альбумин (БСА); пальмитиновую и олеиновую кислоты (0,5 мМ).

Для визуальной и полуколичественной оценки накопления нейтральных липидов в гепатоцитах применяли краситель Oil Red O. Данный анализ проводили в несколько этапов: фиксировали клетки 10% формалином, окрашивали клетки Oil Red O, экстрагировали окрашенные липиды 100% изопропанолом, для полуколичественного определения накопления нейтральных липидов измеряли оптическую плотность на длине волны 490 нм на спектрофотометре.

С помощью набора «Randox Triglycerides» (GPO-PAP) была про­ведена количественная оценка степени накопления ТГ в гепатоцитах энзиматическим колориметрическим методом. Количество ТГ норми­ровали на количество белка в клетках. Анализ содержания белка в клетках проводили с помощью коммерческого набора «Pierce™ BCA Protein Assay Kit» (Thermo Scientific).

Обработку полученных показателей проводили в программе Microsoft Excel, где статистическую значимость между группами оцени­вали по t-критерию Стьюдента для 2-х выборок; различия рассматривали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты и обсуждение. Культивирование клеток HepG2 про­водили в 24-луночном планшете в среде DMEM/F-12, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (ФБС), с добавлением антибиотиков в СО₂-инкубаторе при 37°С в условиях абсолютной влажности. В каждую лунку планшета засевали 1,5×10⁵ клеток. Культуры клеток были разделены на контрольные и экспериментальные (стеатоз) группы. Контрольную группу культивировали в присутствии 1% БСА. При создании клеточной модели стеатоза печени в среду культивирования помимо 1 % БСА вносили пальмитиновую и олеиновую кислоты (в соотношении 1:2). Выбранная пропорция вносимых кислот является наиболее оптимальной, так как она приводила к дозозависимому накоплению липидов внутри клеток без выраженных признаков цито­токсичности [4].

При использовании красителя Oil Red O проводится определение всех нейтральных липидов (ТГ и диацилглицеридов, а также эфиров холестерина), содержащихся в клетках. При использовании красителя Oil Red O капли нейтральных липидов окрашивались в красный цвет (рисунок 1).

Рисунок 1. Окрашенные капли нейтральных липидов в клетках HepG2 красителем Oil Red O, ×40

Поскольку интенсивность окрашивания красителем Oil Red O нейтральных липидов коррелирует с накоплением липидов в клетках, удается оценить содержание нейтральных липидов. В экспериментальной группе (с пальмитиновой и олеиновой кислотами) содержание липидов достоверно увеличилось в 3,2 раза по сравнению с контрольной группой (рисунок 2).

* - p< 0,05 по сравнению с контролем

Рисунок 2. Оценка количества нейтральных липидов в клетках HepG2 при окрашивании Oil Red O. Контроль - контрольная группа клеток с добавлением 1% БСА. ЖК - экспериментальная группа клеток с добавлением 1% БСА и пальмитиновой и олеиновой кислот

Коммерческий набор «Randox Triglycerides» основан на глицерол-3-фосфатном методе (GPO-PAP), где определяется содержание только ТГ. В экспериментальной группе содержание ТГ увеличилось в 5 раз по сравнению с контрольной группой клеток (рисунок 3).

* - p< 0,05 по сравнению с контролем

Рисунок 3. Оценка количества ТГ в клетках HepG2 методом GPO-PAP. Обозначения как на рисунке 2

При сравнении двух вышеперечисленных методов определения липидов в клетках HepG2 видно, что результаты, полученные методом GPO-PAP, сопоставимы с результатами, полученными при спектро­фотометрическом определении окрашенных Oil Red O нейтральных липидов. Наблюдаются повышенные уровни липидов в эксперименталь­ной группе клеток HepG2 по сравнению с контролем.

Заключение. На клетках HepG2 была создана модель стеатоза печени, с использованием которой была проведена количественная оценка содержания нейтральных липидов и ТГ. При добавлении ЖК в клетки HepG2 содержание нейтральных липидов и ТГ повышалось в 5 и 3,2 раза соответственно.

В дальнейшем на отработанной модели стеатоза планируется изучить влияние микробных метаболитов на прогрессирование НАЖБП с целью расширения представлений о роли микробиоты в патогенезе заболевания.

Список литературы:

1. Ивашкин В.Т., Драпкина О.М., Маев И.В. и др. Распространенность неалко­гольной жировой болезни печени у пациентов амбулаторно-поликлинической практики в Российской Федерации: результаты исследования DIREG 2 // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2015. – Т. 25. – № 56. – С. 31-38.
2. Черкашина Е.А., Петренко Л.В., Евстигнеева А.Ю. Неалкогольная жировая болезнь печени: патогенез, диагностика, лечение // Ульяновский медико-биологический журнал. – 2014. – № 1. – С. 35-46.
3. Donato M.T., Tolosa L., Gómez-Lechón M.J. Culture and Functional Characterization of Human Hepatoma HepG2 Cells // Methods in Molecular Biology. – 2015. – № 1250. – P. 77-93.
4. Gómez-Lechón M.J., Donato M.T., Martínez-Romero A., Jiménez N. et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis // Chemico-Biological Interactions. – 2007. – № 165(2). – P. 106-116.
5. Leung C., Rivera L., Furness J.B., Angus P.W. The role of the gut microbiota in NAFLD // Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. – 2016. – Т. 13. - № 7. – P. 412.
6. Rafiei R., Bemanian M., Rafiei F., Bahrami M. et al. Liver disease symptoms in non-alcoholic fatty liver disease and small intestinal bacterial overgrowth // Romanian Journal of Internal Medicine. – 2018. - Т. 1. – № 56(2). – P. 85-89.
7. Wieland A., Frank D.N., Harnke B., Bambha K. Systematic review: microbial dysbiosis and nonalcoholic fatty liver disease // Alimentary pharmacology & therapeutics. – 2015. – Т. 42. – № 9. – P. 1051-1063.