ЗАВИСИМОСТЬ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ОТ ВРЕМЕНИ СОРБЦИИ НА МАГНИТНОМ СОРБЕНТЕ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

DEPENDENCE OF THE EFFICIENCY OF NUCLEIC ACID ISOLATION ON THE TIME OF SORPTION ON MAGNETIC SORBENT AT DIFFERENT TEMPERATURES

Dmitry Petrov

Head of sector, Laboratory of methods and devices of the immune and genetic analysis, Institute for analytical Instrumentation Russian Academy of Science,

Russia, St. Petersburg

Ivan Antifeev

Junior Researcher, Laboratory of methods and devices of the immune and genetic analysis, Institute for analytical Instrumentation Russian Academy of Science,

Russia, St. Petersburg

Natalia Germash

Junior Researcher, Laboratory of methods and devices of the immune and genetic analysis, Institute for analytical Instrumentation Russian Academy of Science,

Russia, St. Petersburg

АННОТАЦИЯ

Одним из ключевых вопросов современных методов анализа ДНК является его выделение и очистка от примесей. В исследованиях проведённых ранее показано, что в определяющей стадией при магнитной сепарации ДНК является стадия сорбции на магнитном сорбенте. Подбор оптимальных условий для этой стадии способен сократить время для экстракции ДНК, при сохранении высокой эффективности. В работе показано, что соблюдение соответствующих температурных режимов позволяет сократить время сорбции в два раза, при сохранении эффективности выделения ДНК.

ABSTRACT

One of the key issues of modern methods of DNA analysis is its isolation and purification from impurities. Previous studies have shown that the determining stage in magnetic separation of DNA is the stage of sorption on a magnetic sorbent. The selection of optimal conditions for this stage can shorten the time for DNA extraction, while maintaining high efficiency. It is shown in the work that the observance of the corresponding temperature regimes makes it possible to reduce the sorption time by half while maintaining the efficiency of DNA extraction.

Ключевые слова: ДНК, воздействие температуры, выделение и очистка нуклеиновых кислот.

Keywords: DNA, exposure to temperature, isolation and purification of nucleic acids.

В настоящее время генетический анализ проб получил очень широкое распространение в медицине, биологии, сельском хозяйстве, экологическом мониторинге. Первой, и часто определяющей, стадией качественного анализа ДНК или РНК (далее НК) на видовую принадлежность или секвенирование, является стадия выделения очистки и концентрирования НК [1].

В последнее время один из самых распространённых методов выделения НК – это магнитная сепарация. В основе этого метода лежит сорбция нуклеиновых кислот на магнитном сорбенте, покрытом силикатной оболочкой [2] в растворе с высоким рН, и дальнейшая десорбция (элюция) в растворе с рН менее близкой к нейтральной или кислой среде. Эффективность такого метода достаточно высока, когда речь идёт о модельных растворах, [3], однако она значительно снижается при работе с пробами, содержащими те или иные мешающие примеси. В исследованиях, проведённых нашим коллективом, ранее отмечалось, что наиболее существенный вклад в изменение эффективности выделения нуклеиновых кислот вносит стадия сорбции НК на силикатной поверхности магнитного сорбента [4]. Существуют различные способы влиять на характеристики сорбции, и массопереноса при сорбции в целом. Одним из самых простых является температурное воздействие – за счёт повышения скорости броуновского движения происходит увеличение скорости диффузионных процессов, и как следствие повышение эффективности выделения НК более чем в два раза, при увеличении температуры приблизительно на 30^оС [2]. Но управление температурными процессами при выделении НК имеет ряд ограничивающих факторов, существенно влияющих на характеристики выделения в целом. Одним из наиболее ощутимых ограничений температурного воздействия является необходимость относительно длительного прогрева пробы, до температуры 60 ^оС -90 ^оС (в зависимости от выбранного состава реагентов и методики выделения). Возможной альтернативой для качественной магнитной сепарации является применение ультразвукового воздействия на различных стадиях выделения НК, а также способа проточного концентрирование НК [5]. Из полученных результатов по исследованию эффективности выделения НК в зависимости от влияющих факторов на этап сорбции видно, что опосредованно время экспозиции также является важной частью эффективности сорбции НК на магнитном сорбенте. Таким образом, для того чтобы установить данную зависимость, а также увязать её с температурой пробы, как важным фактором при массообменных процессах, целью экспериментальной работы является получение графиков зависимости эффективности выделения нуклеиновых кислот при выделении на магнитном сорбенте при различных температурах, и времени сорбции.

Для приготовления модельных растворов ДНК использовали раствор ДНК M. tuberculosis концентрации 1∙10⁷ копий/мкл, входящий в состав набора «Ампли-Туб-РВ» (ООО «Синтол). Для выделения ДНК применяли набор «М-Сорб-ООМ» (ООО «Синтол»). Модельный раствор концентрации 1∙10⁵ копий/мкл готовили методом последовательного разбавления, применяя для этой цели «Лизирующий реагент» (ЛР) из набора «М-Сорб-ООМ».

При количественном определении ДНК использовали реагенты, входящие в состав набора для проведения ПЦР-РВ «Ампли-Туб-РВ»: праймеры, буфер, зонды, олигонуклеотиды, хлорид магния.

Для изучения воздействия температуры на эффективность выделения ДНК при различной температуре применяли термостат «Гном» («ДНК-Технология», Россия) и микроцентрифугу-встряхиватель «Циклотемп-901» (ЦиклоТемп, Россия). Анализ результатов выделения ДНК проводили с помощью амплификатора нуклеиновых кислот «АНК-32» (ИАП РАН, Россия): прибор позволяет оценивать результаты амплификации одновременно из 32 проб. Режим работы (параметры амплификации) выбирали в соответствии с инструкцией к набору «Ампли-Туб-РВ».

Для приготовления исследуемых проб в 800 мкл ЛР добавляли 200 мкл рабочего раствора ДНК и перемешивали с помощью микроцентрифуги-встряхивателя «Циклотемп-901».  Таким образом, концентрация ДНК в пробе, составляла 2∙10⁴ копий/мкл.

При изучении влияния времени сорбции НК и при различной температуре выход ДНК пробирку Эппендорф, содержащую 1 мл пробы, помещали в термостат и выдерживали при каждой температуре 3-5 минут, контролируя достижение заданной температуры в пробе. Температуру изменяли в диапазоне 20 (±2) ÷ 90^оС с шагом 10^оС; при каждой температуре проводили 10 параллельных опытов (n = 10), при изменении времени сорбции 1 минута, 5 минут, 10 минут. Точность поддержания температуры составляет ± 1 ^оС.

После выдерживания 3-5 минут в пробу добавляли магнитный сорбент и нагретый до соответствующей температуры осаждающий буфер, после чего продолжали работу в соответствии с методикой к набору «М-Сорб-ООМ».

Для определения концентрации ДНК отбирали дважды по 10 мкл раствора, полученного при элюировании ДНК, и проводили анализ методом ПЦР-РВ с использованием калибровочных образцов на приборе АНК-32 (n = 2).

В результате проведённых экспериментов получили следующие зависимости, представленные на рисунке 1.

Рисунок 1. Зависимость процента выхода ДНК при выделении с сорбцией в течении различного времени

 Зависимость при выделении с сорбции в течении 1 минуты,  Зависимость при выделении с сорбции в течении 5 минут,  Зависимость при выделении с сорбции в течении 10 минут.

Как видно из полученных зависимостей наибольшую эффективность выделения НК удаётся достичь при сорбции в течении 10 минут, ожидаемо, что оптимум температуры при сорбции находится около 75^оС-85^оС, то есть в соответствие с рекомендациями производителя набора реагентов для выделения НК. При этом выделение ДНК при сорбции в течении 1 минуты не может обеспечить 100% эффективности выделения во всём диапазоне исследуемых температур, даже с учётом погрешностей.

Полученные данные позволяют сделать выводы о том, что при длительном времени сорбции, более 5 минут, удаётся достичь высокой эффективности выделения НК, достаточные для определения даже не высоких концентраций ДНК в пробе, так как показанный процент выделения НК находится выше 90%, а значит способен обеспечить аналитическую точность при выделении НК с начальной концентрацией менее 100 шт/мкл., то есть потери ДНК соизмеримы с погрешностью дозирующих устройств. Таким образом, выявленная зависимость эффективности выделения НК при различных температурах с сорбцией в течении различного времени позволяет при необходимости сокращать время сорбции при выделении, с увеличением температуры пробы, для сохранения эффективности, что может быть крайне важным обстоятельством при массовом анализе проб на содержание НК или выделение и дальнейшую расшифровку последовательности.

Список литературы:

1. Алексеев Я.И., Петров Д.Г. Компания Синтол – Генетический анализ от «А» до «Я» //Аналитика.  - 2016. № 6 (31).  - С. 74-79.
2. Петров Д.Г., Макарова Е.Д., Корнева Н.А., Альдекеева А.С., Князьков Н.Н. Воздействие полей разной природы на выход ДНК при выделении из модельных растворов на двуокиси кремния. 1. Влияние температуры // Научное приборостроение. - 2015. - Т. 25. № 2. - С. 91-101.
3. Дженлода Р.Х., Шкинев В.М., Петров Д.Г., Спиваков Б.Я. Ультразвоковая суспензионная колонка для анализа mycobacterium tuberculosis с использованием наноструктурированного магнитного сорбента. Нанотехнологии в современных материалах технологического и биомедицинского назначения // Материалы научно-практического семинара.  - 2018.  - С. 43-45.
4. Petrov D.G., Antifeev I.E., Germash N.N., Makarova E.D. Analysis of the effectiveness of the stages of the concentration of genetic material // Phys.: Conf. Ser.  - 1400 – p. 033023
5. Dzhenloda R.K., Shkinev V.M., Spivakov B.Y., Petrov D.G. DNA recovery from environmental samples on suspension columns under a combined action of ultrasound and magnetic fields followed by polymerase chain reaction detection // Mendeleev Communications. - 2017. Т. 27. № 3. -  p. 302-303.