ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВЕДЕНИЯ САМЦОВ КРЫС ВИСТАР В СУБЪЕКТИВНОЕ ДНЕВНОЕ И НОЧНОЕ ВРЕМЯ В ТЕСТЕ «ОТКРЫТОЕ ПОЛЕ»

RESEARCH OF THE BEHAVIOR OF MALES OF WISTAR RATS IN SUBJECTIVE DAY AND NIGHT TIME IN THE TEST “OPEN FIELD”

Margarita Zhuravleva

training master of the Department of Human and Animal Physiology of Samara National Research University named after Academician S.P. Koroleva

Russia, Samara

Alexey Inyushkin

professor, Head of the Department of Human and Animal Physiology of Samara National Research University named after Academician S.P. Koroleva

Russia, Samara

АННОТАЦИЯ

Цель исследования заключалась в том, чтобы определить особенности пиптидэргической регуляции биологических ритмов супрахиазматического ядра гипоталамуса. Для этого в стандартном поведенческом тесте «Открытое поле» было исследовано поведение крыс Вистар массой 240-270 грамм в контрольной и экспериментальной группах при интраназальном введении антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 в условиях фазовых сдвигов режимов освещения. В результате выявлены основные периоды воздействия антагониста и особенности проявления поведенческих реакций. Были сделаны выводы о том, что антагонист оказывает воздействие в субъективное ночное время.

ABSTRACT

The purpose of the study was to determine the characteristics of the piptidergic regulation of the biological rhythms of the suprachiasmatic nucleus of the hypothalamus. For this, the behavior of Wistar rats weighing 240-270 grams in the control and experimental groups with intranasal administration of the p-234 kisspeptin receptor antagonist under phase shifts of light conditions was studied in the standard Open Field behavioral test. As a result, the main periods of exposure to the antagonist and features of the manifestation of behavioral reactions were identified. It was concluded that the antagonist has an effect in subjective night time.

Ключевые слова: кисспептин; блокатор р-234; поведение; интраназальное введение веществ; супрахиазматическое ядро гипоталамуса.

Keywords: kisspeptin; p-234 blocker; behavior; intranasal administration of substances; suprachiasmatic nucleus of the hypothalamus.

Супрахиазматическое ядро (СХЯ) гипоталамуса является главным циркадианным осциллятором у человека и млекопитающих. Оно отвечает за биологические ритмы сна и бодрствования. Кроме того, оно также оказывает влияние на метаболизм и поведение. Большое количество работ свидетельствует о его возможном участии в сезонных изменениях поведенческой активности, которая может проявляться в депрессивных состояниях. Также сбоем в работе циркадианного осциллятора является джетлаг - то есть стресс, которому подвергается организм из-за разницы во времени при дальних авиаперелетах. Все живые существа на нашей планете функционируют в соответствии с суточным циклом сна и бодрствования. Путешественники, преодолевающие сразу несколько часовых поясов, знакомы с дискомфортным состоянием, которое может возникнуть из-за разницы между внутренними биологическими часами и внешними раздражителями. Известно, что биологические часы могут регулироваться экзогенно-фотически и эндогенно-при помощи нейропептидов. Кроме того, нервные клетки СХЯ имеют свой биологический внутренний ритм. Данные свойства были исследованы на клеточных культурах [1, c. 5963]. Организм имеет особенности адаптации к условиям окружающей среды, однако разница во времени при пересечении часовых поясов асинхронизирует естественные циклы организма. Разбалансировка биологических ритмов проявляется в усталости, раздражительности и резкой смене настроения. Данный синдром и получил название джетлаг (от англ. jet lag). Важным является механизм, при котором баланс биоритмов может быть заранее смоделирован. Физиологическими модуляторами состояний, связанных с циркадианными ритмами, на данный момент считаются нейропептиды, а также их антагонисты. В данной работе исследовался антагонист кисспептиновых рецепторов р-234, он является блокатором специфических рецепторов KISS1R к кисспептину. Кисспептин был открыт сравнительно недавно в 1996г. в качестве супрессора метастазирования меланомы, однако данные эффекты не подтвердились. Позже была открыта его физиологическая роль в процессе полового созревания и фертильности. Оказалось, что кисспептин играет исключительную роль в процессах полового созревания и гометогенеза. Ген, кодирующий рецептор кисспептина, был описан в 1999 году [2, c. 105]. Исследователи определили кисспептин (KISSl) как рецептор, стоящий в паре с рецептором G-белка GPR-54 [3, c. 1617]. Мутации рецептора KISSlR провоцируют преждевременное половое созревание, а если они происходят в самом гене KISSl, кодирующем лиганд для KISSlR, то это влияет на нормальное течение полового созревания [4, c. 10716; 5, c. 712]. Недавние исследования установили, что данные гены играют важную роль в процессах старения, менопаузе [6, c. 2745], физиологии адипоцитов [7, c. 70], в молекулярной связи между метаболизмом и процессами репродукции [8, c. 829]. 

Нейроны ганадотропин-релизинг гормона (ГнРГ) образуют общий путь контроля фертильности. ГнРГ, выделяемый аксонами, стимулирует секрецию лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего (ФСГ) гормонов передней доли гипофиза. Эти гонадотропины стимулируют стероидогенез и гаметогенез. Стероиды, в свою очередь, действуют по принципу отрицательной обратной связи на гипофиз и гипоталамус [9, c. 1984].

Регуляция работы организма, как говорилось выше, настраивается фотически и нефотически (при помощи нейропептидов). Циркадианные ритмы синхронизируются с 24-часовым световым циклом дня и ночи. Световые сигналы настраивают СХЯ через ретиногипоталамический путь. На синхронизацию могут влиять и другие сигналы, например, изменения температуры или пищеварения. СХЯ гипоталамуса является парным. Оно расположено в основании переднего отдела гипоталамуса, дорсально по отношению к перекрестку зрительных нервов по обеим сторонам третьего желудочка. Оно включает у мышей примерно 20000 нейронов (по 10000 в правом и левом ядрах), (у крыс, по другим данным, 16000) и примерно 100000 нейронов у человека.  Рецепторы гонадных стероидов экспрессируются почти в каждом сайте, который получает прямую проекцию от СХЯ [10, c. 551; 11, c. 56;  12, c. 1870; 13, c. 123; 14, c. 30].

Циркадианные ритмы могут контролировать экспрессии генов в тканях, многие из данных генов являются тканеспецифичными.  Тканеспецифичность-это процесс транскрипции группы генов, то есть перенос генетической информации с ДНК на РНК, которые определяют будущую «специализацию» клеток [15, c. 435]. Фотическая настройка циркадианного осциллятора может при этом осуществляться напрямую, через ретинореципиентные нейроны ядра. Данные нейроны реагируют с генами Per1 и Per2, при получении светового импульса. Световые импульсы попадают в СХЯ посредством трех основных путей: ретиногипоталамическим через сетчатку, геникулогипоталамическим трактом через межколенчатую пластинку и серотонинергическим входом из дорсального и медиального ядер. На данные входные пути могут влиять также гонадные гормоны, так как межколенчатая пластинка и ядра-рафа, через которые лежат вышеперечисленные пути, экспрессируют либо андрогенные рецепторы, либо эстрогеновые рецепторы, либо комбинации обоих [16, c. 1539].

В данной работе проанализировано поведение крыс самцов Вистар в тесте «Открытое поле» в условиях фазовых сдвигов режимов освещения. Поведенческие тесты позволяют определить реакции крыс на интраназальное введении антагонистов. В условиях смены режима освещения данная методика позволяет определить влияние фотических и нефотических факторов для возможной модификации поведения. Кроме того, благодаря данной методике становится возможным выдвигать предположения о настройке циркадианного осциллятора.

Материалы и методы:

Все экспериментальные протоколы были согласованы и одобрены комиссией по биологической этике Самарского национального исследовательского университета имени академика С.П. Королева.

Исследовали самцов крыс Вистар массой 240-270 г. Контрольная и экспериментальная группа включала по 6 животных. Животные получали пищу и питьевую воду без ограничений. Содержали животных в виварии Самарского университета в режиме освещения 12:12 ч. Экспериментальным животным вводили 10 мкл в концентрации 0,1 мМ антагонист кисспептиновых рецепторов р-234. Введение вещества производили в течении трех последовательных суток (троекратно) в соответствии с графиком. Контрольным, в соответствии с графиком для экспериментальной, интраназально вводили воду для инъекций в объёме 10 мкл. Исследования проводились в условиях фазовых сдвигов режимов освещения в шести контрольных точках субъективного ночного и дневного времени. Регистрацию проводили каждый раз в 16:00.  Брали по три контрольных и экспериментальные точки субъективного дневного времени ZT=2, 6, 10 часов (ZT=0 соответствовал моменту включения освещения при световом режиме 12:12 часов) и в ночное время ZT=14, 18, 22 часа (ZT=0 соответствовал моменту выключения освещения при световом режиме 12:12 часов). Определяли поведенческие параметры «количество пересечённых квадратов» в центре, 2/3 поля и на периферии. Сравнивали полученные поведенческие параметры. Поведенческие параметры регистрировали через 15 минут после интраназального введения. В течении 10 минут производили регистрацию поведенческих параметров в тесте «Открытое поле». Были зарегистрированы следующие параметры: количество пересечённых квадратов в центре, 2/3 поля и на периферии. Осуществляли видео-трекинг, для этого устанавливали камеру Panasonic fullhd hc-x810 на штатив. Обработку полученных данных производили при помощи программ ANY-maze 4.99., Excel и SigmaPlot 12.5. Оценку исследуемых показателей проводили при помощи t-теста или теста Манна-Уитни. При помощи теста Левена проверяли нормальность распределения. Статистически значимыми считались параметры при р<0,05.

Результаты исследований:

В результате исследований поведения самцов крыс Вистар в установке "Открытое поле" при интраназальном введении антагониста кисспептиновых рецепторов р-234 в условиях фазовых сдвигов режимов освещения, получены следующие данные о количестве пересеченных квадратов в центре, 2/3 поля и на периферии. Проведено сравнение полученных показателей.

Основные изменения поведенческой активности проявились в субъективные дневные часы. Изменения в количестве пересеченных квадратов проявились во временном фрейме ZT=14 при пересечении 2/3 поля (P = 0,001), а также при пересечении квадратов в центре поля (P = 0,027). Кроме того различия в поведенческой активности, были выявлены во временном фрейме ZT=18 (P = 0,007) при пересечении квадратов на периферии поля.

Полученные данные определяют временной интервал, в котором проявляется активность рецептора к кисспептину. Кроме того, выявленные изменения свидетельствует о взаимосвязи кисспептиновой сигнализации и поведенческой активности, а также о фотической настройке циркадианного осциллятора. Эффекты, оказываемые антагонистом кисспептиновых рецепторов р-243 в определенных временных фреймах, выражаются в снижении уровня тревожности, увеличении исследовательского поведения, повышения адапционной активности, снижения общей активности, снижении стрессовых реакций.

Выводы:

Получены данные о том, что антагонист кисспептиновых рецепторов р-234 влияет на поведение крыс самцов в субъективное ночное время. Основными проявлениями является снижение стрессовых реакций у животных.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 18-34-00542 «Исследование роли антагониста кисспептина (Р-234) в регуляции биологических ритмов у крыс».

Список литературы:

1.  Inouye S. T. Persistence of circadian rhythmicity in a mammalian hypothalamic "island" containing the suprachiasmatic nucleus / Inouye S. T., Kawamura H.  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1979. - Vol. 76. № 11. - P. 5962 -5966. 
2.  Lee D. Discovery of a receptor related to the galanin receptors / Lee D, Nguyen T, O'Neill G, et al. // FEBS Letters. – 1999. - Vol. 446. № 1. - P.  103-107.
3.  Seminara S. The GPR54 gene as a regulator of puberty / Seminara S, Messager S, Chatzidaki E, et al. // The New England Journal of Medicine. - 2003. - №349 - P. 1614-1627.
4. D'Anglemont de T. Hypogo-nadotropic hypogonadism in mice lacking a functional Kiss1 gene / d'Anglemont de T, Fagg L, Dixon J, et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2007. - Vol. 104 №25. - P. 10714-10719.
5. Teles M. A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty / Teles M, Bianco S, Brito V, et al. // New England Journal of Medicine. - 2008. - №358 - P.709-715.
6. Rometo A. Hypertrophy and increased kisspeptin gene expression in the hypo-thalamic infundibular nucleus of postmenopausal women and ovariectomized monkeys / Rometo A, Krajewski S, Voytko M, et al. // The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. - 2007. - №92 - P. 2744-2750.
7. Brown R. KiSS-1 mRNA in adipose tissue is regulated by sex hormones and food intake / Brown R, Imran S, Ur E, et al. // Molecular and Cellular Endocrinology. - 2008. - №281 - P. 64-72.
8. [8] Hill J. Hypothalamic pathways linking energy balance and reproduction / Hill J, Elmquist J, Elias C, et al. // American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. - 2008. - Vol. 294. №5 - P. 827-835.
9. Pielecka-Fortuna J. Kisspeptin acts directly and indirectly to increase Gonadotro-pin-Releasing hormone neuron activity and its effects are modulated by stradiol. / Pielecka-Fortuna J, Chu Z, Moenter S. // Endocrinology. - 2008. - Vol. 149. №4 - P. 1979-1986.
10. Welsh DK. Suprachiasmatic Nucleus: Cell Autonomy and Network Properties / Welsh DK, Takahashi JS, Kay SA. // Annu Rev Physiol. - 2010. - №72 - Р. 551-577.
11. Van Esseveldt KE. The suprachiasmatic nucleus and the circadian time-keeping system revisited / van Esseveldt KE, Lehman MN, Boer GJ. // Brain Res Rev. -  2000.  - Vol. 33. №1 - P. 34-77.
12. Binder M. D. Encyclopedia of Neuroscience / Binder M. D., Hirokawa N. Windhorst U. (ed.). // Springer. - 2009. - P. 1870.
13. Bailey M. Sex differences in circadian timing systems: implications for disease / Bailey M, Silver R. // Frontiers in Neuroendocrinology. - 2014. - Vol. 35. № 1 - P. 111-139.
14. Morin L.P. The circadian visual system / Morin LP, Allen CN // Brain Res Rev. - 2006. -  Vol. 51 № 1. - P. 1–60.
15. Doherty CJ, Kay SA. Circadian control of global gene expression patterns / Doherty CJ, Kay SA. // Annu Rev Genet. - 2010. №  44. - P. 419-444.
16. Yan L. Differential induction and localization of mPer1 and mPer2 during advancing and delaying phase shifts. / Yan L, Silver R. // Eur J Neurosci. – 2002. -  Vol.16. №8 - P. 1531–1540.