СПОСОБ  ПОЛУЧЕНИЯ  КАРОТИНОИДОВ  ИЗ  РАСТИТЕЛЬНОГО  СЫРЬЯ

Курегян  Анна  Гургеновна

канд.  фармац.  наук,  старший  преподаватель  Пятигорского  медико-фармацевтического  института  —  филиала  ГБОУ  ВПО  ВолгГМУ,  г.  Пятигорск

E-mail:  Kooreguan@mail.ru

Печинский  Станислав  Витальевич

канд.  фармац.  наук,  преподаватель  Пятигорского  медико-фармацевтического  института  —  филиала  ГБОУ  ВПО  ВолгГМУ,  г.  Пятигорск

TECHNIQUE  FOR  PRODUCING  CAROTENOIDS  FROM  PLANT  RAW  MATERIAL

Kuregyan  Anna

candidate  of  Pharmaceutical  Sciences,  senior  teacher  of  Pyatigorsk  Medical  Pharmaceutical  Institute  —  Branch  of  Volgograd  State  Medical  University,  Pyatigorsk

Pechinsky  Stanislav

candidate  of  Pharmaceutical  Sciences,  teacher  of  Pyatigorsk  Medical  Pharmaceutical  Institute  —  Branch  of  Volgograd  State  Medical  University,  Pyatigorsk

АННОТАЦИЯ

Цель:  разработка  унифицированного  способа  извлечения  каротиноидов  из  растительных  объектов.

Метод:  для  реализации  цели  был  применен  метод  жидкостной  экстракции  с  использованием  нескольких  смесей  растворителей. 

Результат:  предложена  унифицированная  схема  выделения  суммы  каротиноидов.

Выводы:  разработанная  схема  выделения  каротиноидов  может  быть  применена  практически  для  любого  растительного  сырья.  Технологические  приемы  позволяют  минимизировать  влияние  светового  потока,  температурного  перепада,  механического  воздействия  на  извлекаемые  соединения  и  получить  конечный  продукт  без  балластных  веществ.

ABSTRACT

The  aim  of  the  research  was  to  develop  the  unified  technique  for  extracting  carotenoids  from  plant  resources.  The  method  of  solvent  extraction  with  several  solvent  mixtures  was  used  there.  As  a  result  there  was  proposed  a  unified  scheme  for  the  extraction  of  a  sum  of  carotenoids.  To  conclude,  the  developed  scheme  for  carotenoids’  extraction  can  be  used  almost  for  any  plant  raw  material.  Production  methods  allow  minimizing  the  influence  of  light  flux,  temperature  difference,  and  mechanical  stress  on  producible  compounds  and  getting  the  end  product  without  ballast  substances.

Ключевые  слова:  способ  изолирования;  жидкостная  экстракция;  каротиноиды.

Keywords:  insulating  technology;  solvent  extraction;  carotenoids.

В  настоящее  время  значительное  число  практических  медицинских  работников  отмечает  общее  ухудшение  физического  состояния  людей,  которые  считают  себя  совершенно  здоровыми  и  у  которых  не  выявлено  явных  патологий.  Большинство  клиницистов  связывают  такую  тенденцию  со  снижением  восстановительных  и  резервных  функций  организма,  а  также  со  снижением  иммунитета  современного  человека  [3,  с.  81,  4,  с.  7]. 

Нарастающая  неблагоприятная  экологическая  обстановка  практически  во  всех  странах  мира  предопределила  развитие  ряда  исследований,  связанных  с  разработкой  лечебно-профилактических  (ЛПП)  и  лекарственных  препаратов  (ЛП),  позволяющих  повысить  адаптационные  резервы  и  иммунный  статус  организма  человека  в  сложившихся  современных  условиях. 

Представители  класса  каротиноидов  обладают  широким  спектром  фармакологических  свойств,  основными  из  которых  являются  антиоксидантная  [5,  с.  42],  радиопротекторная  [7,  с.  91],  фотопротекторная  [2,  с.  19],  провитаминная  [6,  с.  147],  антиканцерогенная  [1,  с.  3]  и  другие  виды  активности.

Для  реализации  научных  исследований  в  области  изучения  каротиноидов  необходимо  объединение  ученых,  работающих  как  в  области  фундаментальных,  так  и  прикладных  дисциплин.  Такое  научное  сотрудничество  определяется  неравномерным  распределением  каротиноидов  в  различных  природных  объектах,  сложностью  структуры  соединений  этого  класса  и  их  нестабильностью.  Так,  каротиноиды  крайне  неустойчивы  к  воздействию  света,  кислорода  и  температуры,  под  воздействием  которых  происходят  процессы  изомеризации,  дегидратации  структуры  каротиноидов,  что  приводит  к  изменению  их  активности,  а  это  в  свою  очередь  необходимо  учитывать  в  исследованиях  по  созданию  ЛП  и  ЛПП.

Очевидно,  что  одним  из  направлений  решения  проблемы  создания  ЛП  и  ЛПП,  содержащих  каротиноиды,  является  разработка  унифицированного  способа  выделения  этих  соединений  из  природных  объектов.

Извлечение  каротиноидов  предпочтительнее  проводить  из  растительных  объектов  как  можно  быстрее,  так  как  в  процессе  хранения  происходит  изменение  состава  каротиноидов  и  их  активности  в  результате  процессов  окисления  и  ферментативного  расщепления.  Если  не  представляется  возможным  использовать  свежие  объекты  в  качестве  исходного  сырья,  то  можно  их  заморозить  с  целью  уменьшения  деструктивных  процессов.

Целью  исследования  являлась  разработка  унифицированного  способа  извлечения  каротиноидов  из  растительных  объектов. 

Объекты  и  методы.  В  качестве  источников  каротиноидов  последовательно  были  использованы  плоды  томатов,  моркови,  сладкого  перца,  кукурузы  и  др. 

Для  выделения  каротиноидов  из  сырьевых  источников  был  применен  метод  жидкостной  экстракции  с  использованием  нескольких  смесей  растворителей  и  экстрагентов. 

Результаты  и  их  обсуждение.  В  ходе  эксперимента  проводились  исследования  по  получению  и  установлению  каротиноидного  состава  извлечения,  полученного  из  нескольких  растительных  объектов.  Предварительно  исходное  сырье  измельчали  с  помощью  электрического  блендера,  добавляя  гидрокарбонат  натрия  в  массовом  соотношении  1:10  с  целью  нейтрализации  органических  кислот,  кроме  того,  для  уменьшения  действия  кислорода  воздуха  и  понижения  температуры,  которая  повышается  при  механическом  воздействии,  в  систему  вносили  кусочки  сухого  льда.  Так  как  сами  каротиноиды  являются  светочувствительными  соединениями,  на  всех  этапах  изолирования  необходимо  было  уменьшать  воздействия  света.  Для  этого  колбы  оборачивали  черной  бумагой,  а  промежуточные  продукты  хранили  в  банках  оранжевого  стекла  в  темном  месте.  Температура,  кислая  среда,  окисление  кислородом  воздуха  и  свет  приводят  к  изменению  состава  каротиноидов  особенно  их  геометрических  изомеров  [9,  с.  12].  Именно  поэтому  в  ходе  разработки  способа  изолирования  каротиноидов  было  необходимо  минимизировать  влияние  этих  факторов  на  сам  процесс  получения  и  состав  конечного  извлечения.

Первичную  экстракцию  проводили  смесью  ацетона  и  метилового  спирта  в  соотношении  3:1.  Дальнейшее  увеличение  количества  метилового  спирта  не  приводило  к  значимому  увеличению  степени  экстракции,  которую  контролировали  по  величине  оптической  плотности  в  интервале  длин  волн  от  350  до  500  нм.  Полученные  экстракты  фильтровали  и  уменьшали  объем  в  роторном  испарителе  примерно  в  два  раза.  К  полученному  раствору  прибавляли  гексана  в  количестве  равном  объему  раствора,  перемешивали  в  делительной  воронке.  Следует  отметить,  что  интенсивное  перемешивание  приводит  к  образованию  эмульсии,  для  нивелирования  этого  процесса  в  систему  вводили  хлорид  натрия  или  спирт  этиловый.  Органический  слой  отделяли  и  дополнительно  промывали  насыщенным  раствором  хлорида  натрия. 

Полученные  органические  экстракты  объединяли  и  сушили  в  роторном  испарителе  до  полного  удаления  растворителя.  Экстракт  растворяли  в  этиловом  спирте  в  соотношении  1:10,  в  случае  необходимости  для  увеличения  растворимости  добавляли  диэтиловый  эфир  в  количестве  5—10  %.  Затем  добавляли  50  %  раствор  гидроксида  калия  в  соотношении  1:10.  Полученный  раствор  помещали  в  склянку  оранжевого  стекла,  продували  азотом  и  плотно  укупоривали  крышкой.  Раствор  помещали  в  темное  место  на  8—10  часов.  После  омыления  добавляли  диэтиловый  эфир,  отделяя  водный  слой  в  делительной  воронке.  Процесс  омыления  позволяет  очистить  экстракт  от  жирных  кислот,  хлорофилла  и  восковых  эфиров.  Полученный  эфирный  экстракт  промывали  достаточное  количество  раз  до  полного  удаления  гидроксида  калия,  то  есть  до  достижения  нейтральной  среды.  Далее  уменьшали  объем  полученного  экстракта  в  роторном  испарителе  до  0,5  мл.

Полученный  продукт  помещали  в  стеклянную  колонку  диаметром  1  см,  заполненную  10  г  алюминия  оксида  для  хроматографии  III  степени  активности  и  гексаном.  Для  уменьшения  воздействия  света  на  экстракт  колонку  предварительно  оборачивали  черной  бумагой.  Элюирование  проводили  последовательно  сначала  100  мл  гексана,  затем  100  мл  смеси  гексан  —  диэтиловый  эфир  (1:1),  далее  100  мл  смеси  диэтиловый  эфир  и  спирт  (20:1).  Разделение  каротиноидов  на  колонке  можно  оценивать  визуально  по  продвижению  желтых,  оранжевых  и  красных  зон.  Полученные  экстракты  первой  фракции,  содержащей  каротины,  и  третей,  содержащей  ксантофиллы,  упаривали  в  роторном  испарителе  до  объема  1  мл  и  запаивали  в  ампулы  оранжевого  стекла,  заполненные  азотом.  Хранили  полученные  образцы  в  темном  месте  при  температуре  20°С.

Разделение  суммы  каротиноидов  в  экстракте  на  индивидуальные  соединения  проводили  методом  хроматографии  в  тонком  слое  сорбента.  Первую  фракцию,  содержащую  каротины,  хроматографировали  на  пластинках  «Силикагель  С  60  F  254».  С  целью  устранения  процесса  изомеризации,  который  происходит  с  каротиноидами  при  их  контакте  с  достаточно  кислым  оксидом  кремния,  и  образования  эпоксидных  производных  каротиноидов  хроматографические  пластинки  предварительно  обрабатывали  буферным  раствором  с  рН=7.  В  качестве  подвижной  фазы  использовали  смесь  ацетон  —  гексан  (1:20).  По  результатам  эксперимента  на  хроматограмме  были  детектированы  [8,  с.  54]  зоны  β-каротина  с  величиной  коэффициента  подвижности  (R_f)  —  около  0,4  и  ликопина  —  около  0,6. 

Третью  фракцию  извлечения  хроматогафировали  в  системе  растворителей  диэтиловый  эфир  —  спирт  этиловый  (1:20).  В  качестве  неподвижной  фазы  использовали  пластинки  «Кизильгур  F  254».  В  результате  эксперимента  на  хроматограмме  были  детектированы  следующие  каротиноиды:  неоксантин  (R_f=0,3),  виолоксантин  (R_f=0,5).  Третье  пятно  с  коэффициентом  подвижности  около  0,6  представляло  собой  два  неразделенных  соединения  лютеин  и  зеаксантин.  Для  разделения  этих  каротиноидов  пластинку  после  хроматографирования  высушивали,  переворачивали  на  90°  и  вторично  хроматографировали  в  системе  растворителей  ацетон  —  гексан  (1:3).  На  пластинке  детектировали  две  зоны  желтого  цвета:  первая,  соответствующая  зеаксантину  с  R_f  0,4,  и  вторая  —  лютеину  с  R_f  0,6. 

Далее  зоны,  соответствующие  индивидуальным  каротиноидам,  элюировали  хлороформом  и  сушили  в  токе  азота. 

Полученные  каротиноиды  хранили  в  ампулах  желтого  стекла  в  защищенном  от  света  месте  при  температуре  около  20°С.

Выводы.  В  ходе  эксперимента  разработана  унифицированная  схема  выделения  суммы  каротиноидов  из  растительных  объектов,  которая  может  быть  применена  практически  для  любого  сырьевого  источника.  Предложенная  жидкостная  экстракция  позволяет  достаточно  полно  извлекать  весь  каротиноидный  состав  за  счет  использования  различных  органических  растворителей  на  протяжении  всего  процесса  экстракции.  Кроме  того,  некоторые  технологические  приемы  позволяют  минимизировать  влияние  светового  потока,  температурного  перепада,  механического  воздействия  на  извлекаемые  соединения.  Стадия  омыления  требует  достаточно  значительных  временных  затрат,  однако  является  оправданной,  т.  к.  позволяет  очистить  экстракт  от  балластных  веществ,  что  значительно  повышает  степень  чистоты  получаемого  извлечения,  а  это  является  важнейшим  критерием  для  экстрактов,  используемых  в  медицинских  и  фармацевтических  целях.

Список  литературы:

1.Газиев  А.И.  Ликопин  —  потенциальное  средство  профилактики  рака  и  сердечно-сосудистой  патологии  //  Вопросы  биологической,  медицинской  и  фармацевтической  химии.  —  2001.  —  №  3.  —  С.  3—11.

2.Дейнека  В.И.,  Шапошников  А.А.,  Дейнека  Л.А.  и  др.  Каротиноиды:  строение,  биологические  функции  и  перспективы  использования  //  Научные  ведомости  БелГУ.  —  2008.  —  №  6.  —  С.  19—25.

3. Захарова  И.Н.,  Горяйнова  А.Н.  Бета-каротин  в  комплексной  терапии  часто  болеющих  детей  //  Вопросы  практической  педиатрии.  —  2011.  —  №  4.  —  С.  81—84.

4.Пономарев  Т.И.,  Добряков  Ю.И.  Об  эффективности  применения  хаурантина  при  стрессорном  воздействии  //  В  мире  научных  открытий.  —  2009.  —  №  6.  —  С.  7—11. 

5.Сергеев  А.В.,  Коростылес  С.А.,  Шяренешева  И.И.  Иммуномодулирующая  и  антиканцерогенная  активность  каротиноидов  //  Вопросы  медицинской  химии.  —  1992.  —  №  4.  —  С.  42—45.

6.Ульяновский  Н.В.,  Косяков  Д.С.,  Боголицын  К.Г.  и  др.  Разработка  экспрессных  методов  аналитической  экстракции  каротиноидов  из  растительного  сырья  //  Химия  растительного  сырья.  —  2012.  —  №  4.  —  С.  147—152.

7.Шашакина  М.Я.,  Шашкин  П.Н.,  Сергеев  А.В.  Каротиноиды  как  основа  для  создания  лечебно-профилактических  средств  //  Российский  биотерапевтический  журнал.  —  2009.  —  №  8.  Т.  8,  С.  91—98.

8.Чечета  О.В.,  Сафонова  Е.Ф.,  Сливкин  А.И.  Изучение  хроматографических  характеристик  b-каротина  в  тонком  слое  сорбента  //  Хим.-фармац.  журн.  —  2012.  —  №  5.  —  С.  54—56.

9.Чечета  О.В.,  Сафонова  Е.Ф.,  Сливкин  А.И.  Стабильность  каротиноидов  в  растительных  маслах  при  хранении  //  Фармация.  —  2008.  —  №  2.  —  С.  12—14.