ОТВЕТ  ГЕНОМА  И  СОСТОЯНИЕ  СИСТЕМЫ  ГЛУТАТИОНА  В  КОРЕ  ГОЛОВНОГО  МОЗГА  КРЫС  С  ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ  НАРУШЕНИЕМ  МОЗГОВОГО  КРОВООБРАЩЕНИЯ  НА  ФОНЕ  ТЕРАПИИ  ТИОЛ-СОДЕРЖАЩИМИ  АНТИОКСИДАНТАМИ

Горбачева  Светлана  Васильевна

Канд.  биол.  наук,  доцент  кафедры  биохимии  и  лаб.диагностики

Запорожского  государственного  медицинского  университета, 
Украина,  г.  Запорожье

Е-mail: 

Беленичев  Игорь  Федорович

д-р  биол.  наук,  заведующий  кафедрой  фармакологии  и  мед.рецептуры

Запорожского  государственного  медицинского  университета,

Украина,  г.  Запорожье

GENOME  RESPONSE  AND  CONDITION  OF  GLUTATHIONE  SYSTEM  IN  CEREBRAL  CORTEX  OF  RATS  WITH  EXPERIMENTAL  CEREBRAL  CIRCULATORY  DISTURBANCE  AS  A  RESULT  OF  THIOL-BASED  ANTIOXIDANTS  THERAPY

Svetlana  Gorbacheva

PhD,  Associate  Professor  at  the  Department  of  Biochemistry  and  laboratory  diagnostics  of

Zaporozhian  state  medical  university,

Ukraine,  Zaporozhye

Igor  Belenichev

PhD,  Head  of  the  Department  of  pharmacology  and  medical  formulation  of  Zaporozhian  state  medical  university, 
Ukraine,  Zaporozhye

АННОТАЦИЯ

Статья  посвящена  изучению  влияния  препаратов,  содержащих  тиоловую  группу  на  экспрессию  генов  c-fos  и  bcl-2,  а  также  на  уровень  глутатиона  в  условиях  экспериментального  нарушения  мозгового  кровообращения.  Показано,  что  введение  изучаемых  препаратов  вызывает  нормализацию  генной  активности  за  счет  предотвращения  смещения  редокс-потенциала  нейронов  в  сторону  окисленных  интермедиатов  и  развития  оксидативного  стресса.  Отмеченные  эффекты  объясняются  наличием  в  их  структуре  SH-групп,  способных  ограничивать  цитотоксичность  активных  дериватов  оксида  азота.

ABSTRACT

The  article  is  devoted  to  examination  of  drugs  influence  which  contain  thiol  group  for  c-fos  and  bcl-2  gene  expression  and  also  glutathione  level  in  conditions  of  experimental  cerebral  circulatory  disturbance.  It  is  shown,  that  introduction  of  medicines  which  are  studying  causes  normalization  of  genic  activity  due  to  the  prevention  of  redox  potential  shift  of  neurons  towards  oxidized  intermediates  and  development  of  oxidative  stress.  Denoted  effects  are  explained  by  the  presence  of  SH-groups  in  their  structure  which  are  able  to  restrict  active  derivatives  cytotoxicity  of  nitric  oxide.

Ключевые  слова:  тиоловые  группы;  глутатион;  гены  раннего  реагирования;  апоптоз;  оксид  азота

Keywords:  thiol  groups;  glutathione;  early  response  genes;  apoptosis;  nitric  oxide

Мозговой  инсульт  наряду  с  ишемической  болезнью  сердца  и  онкопатологией  является  одной  из  ведущих  причин  смертности  населения  во  всем  мире.  В  последние  годы  патогенетические  механизмы  цереброваскулярной  патологии  изучаются  не  только  на  органном,  но  и  на  клеточном  уровне  [8,  с.  87]. 

Запуск  программы,  ведущей  к  смерти  нейрона  в  условиях  ишемического  повреждения,  может  осуществляться  цитокинами,  активными  формами  кислорода  (АФК),  дериватами  оксида  азота,  окисленными  тиолами,  продуктами  окислительной  модификации  белков  и  нуклеиновых  кислот.  При  действии  на  клетку  подобных  факторов,  в  ней  запускается  множество  сигнальных  путей,  ведущих  к  нейтрализации  последствий  их  повреждающего  действия  или,  в  случае  непоправимого  ущерба,  к  элиминации  клетки.  Такая  элиминация  поврежденных  клеток  происходит  по  пути  или  апоптоза  –  запрограммированной  клеточной  гибели,  или  некроза.  К  наиболее  изученным  факторам,  способным  запускать  в  нейронах  апоптоз,  относится  оксид  азота  (NO)  [5,  с.  122].  Значительные  количества  NO,  образующиеся  в  условиях  ишемии,  могут  взаимодействовать  с  гемовым  железом  и  парными  тиольными  группами,  образуя  динитрозольный  комплекс  железа  (DNIC).  DNIC  является  сильным  нитрозилирующим  соединением,  взаимодействует  с  тиолами  белков,  гистидином,  метионином,  цистеином,  глутатионом  и  образует  N-  и  S-нитрозотиолы  [1,  с.  149].  Падение  уровня  восстановленных  интермедиатов  тиол-дисульфидной  системы,  в  первую  очередь  глутатиона,  вызывает  изменение  редокс-статуса  клетки  и,  возможно,  действует  как  триггерное  звено  для  других  компонентов,  существенных  для  процесса  транскрипции.  Такая  возможность  показана  в  отношении  белков  NF-κB,  АР-1  и  р53  [11,  с.  1372].  Подобное  отмечается  и  для  таких  транскрипционных  факторов,  как  Fos,  Jun  и  Nrf2  [13,  с.  2958].  Согласно  современным  представлениям  снижение  уровня  восстановленного  глутатиона  (GSH)  ниже  определенного  порогового  значения  ведет  к  появлению  сигнала  к  развитию  апоптоза,  который  инициируется  активацией  рецептора  смерти  или  митохондриальным  апоптотическим  сигналингом.  Напротив,  повышение  содержания  GSH  обеспечивает  клеточную  защиту  от  Fas-индуцируемого  апоптоза  [9,  с.  862].  Таким  образом,  соотношение  уровней  восстановленного  и  окисленного  глутатиона  играет  роль  своеобразного  «переключателя»  от  фазы  пролиферации  к  фазе  дифференцировки,  и  впоследствии  к  апоптозу  [2,  с.  302]. 

Нашими  предыдущими  исследованиями  показано  положительное  влияние  тиол-содержащих  препаратов  –  доноров  SH-групп  в  условиях  ишемического  повреждения  головного  мозга  на  показатели  антиоксидантной  системы  и  гиперпродукцию  NO  [6,  с.  33-38].  Перспективным  является  изучение  их  действия  на  генные  механизмы,  развивающиеся  на  фоне  ишемического  повреждения  головного  мозга  с  целью  выявления  возможностей  модуляции  клеточной  гибели  путем  повышения  уровня  эндогенного  восстановленного  глутатиона.  Этому  и  посвящено  данное  экспериментальное  исследование.

Материалы  и  методы

Опыты  выполнены  на  белых  беспородных  крысах  массой  180–200  г,  обоего  пола,  полученных  из  питомника  ГУ  «Институт  фармакологии  и  токсикологии  АМН  Украины».  Экспериментальные  животные  были  распределенны  на  6  групп:  І  –  ложнооперированные  животные,  ІІ  –  животные  с  экспериментальным  нарушением  мозгового  кровообращения  НМК  (контроль),  ІІІ  –  НМК  +  тиотриазолин  (50  мг/кг),  ІV  –  НМК+  ангиолин  (50  мг/кг),  V  –  НМК  +  тиоцетам  (125  мг/кг),  VI  –  НМК  +  липоевая  кислота  (50  мг/кг),  Все  экспериментальные  процедуры  и  оперативные  вмешательства  осуществляли  в  соответствии  с  «Положением  об  использовании  лабораторных  животных  в  биомедицинских  исследованиях».  Нарушение  мозгового  кровообращения  вызывали  необратимой  двухсторонней  окклюзией  общих  сонных  артерий.  Процедуру  выполняли  под  этаминал-натриевым  наркозом  (40  мг/кг),  путём  хирургического  доступа  выделяли  общие  сонные  артерии,  подводили  под  них  шёлковые  лигатуры  и  перевязывали.  Учитывая  высокую  смертность  при  данной  модельной  патологии,  использовали  такое  количество  животных,  чтобы  каждая  экспериментальная  группа  состояла  из  10  особей.  Препараты  вводили  внутрибрюшинно  указанными  дозами  1  раз  в  сутки  на  протяжении  18  дней  наблюдения,  начиная  момента  выхода  животных  с  наркоза.  Животным  І  та  ІІ  групп  на  протяжении  исследования  в  соответствующем  объеме  внутрбрюшинно  вводили  физиологический  раствор.  Из  эксперимента  животных  выводили  под  этаминал-натриевым  наркозом  (40  мг/кг)  [7,  с.  28–32].

Для  иммуноферментных  и  биохимических  исследований  использованы  фрагменты,  находящихся  в  области  сенсо-моторной  зоны  коры  головного  мозга  и  гомогенизированные  в  жидком  азоте.  Цитозольную  фракцию  выделяли  методом  дифференциального  центрифугирования  (15  000  g)  при  температуре  +4  ^оС  на  0,15  М  фосфатном  буфере  рН  7,8.  Содержание  нитротирозина  определяли  с  помощью  твердофазного  иммуноферментного  анализа  с  использованием  стандартного  тест-набора  "Nitrotirosine  ELISA  Kit"  ("HyCult  biotechnology")  в  соответствии  с  прилагаемой  к  набору  инструкции.  Уровень  SH-групп  определяли  спектрофотометрически  [10,  с.  231].  Содержание  окисленного  и  восстановленного  глутатиона  определяли  флюорометрически  [3,  с.  64]. 

Для  проведения  иммуногистохимических  исследований  головной  мозг  животных  помещали  на  сутки  в  фиксатор  Буэна  (18  часов)  и  после  стандартной  гистологической  проводки  ткань  заключали  в  парапласт  X-TRA.  На  ротационном  микротоме  изготавливались  15-микронные  срезы  CA1  зоны  гиппокампа,  которые  депарафинировались  по  стандартной  методике.  Для  выявления  экспрессии  гена  раннего  реагирования  c-fos  и  антиапоптического  белка  bcl-2  в  CA1-зоне  гиппокампа,  использовали  иммуногистохимический  метод  непрямой  иммунофлюоресцеции.  Сперва  на  срезы  наносили  первичные  антитела  к  определяемому  белку  (Sigma  Chemical,  USA)  и  инкубировали  при  +4⁰  С  24  часа.  После  инкубации  срезы  трижды  промывали  0,1  М  фосфатным  буфером.  Затем  на  образцы  наносили  вторичные  антитела  (флюоресцент  коньюгированный  козий  IgG)  (Sigma  Chemical,  USA)  и  инкубировали  при  комнатной  температуре  60  мин.  После  инкубации  срезы  промывали  0,1  М  фосфатным  буфером.  На  флюоресцентном  микроскопе  Axioskop  (Ziess,  Germany)  исследовали  fos-иммунопозитивные  и  bcl-2-иммунопозитивные  нейроны.  Изображение  иммунопозитивных  нейронов  CA1-  зоны  гиппокампа,  получаемые  на  микроскопе,  с  помощью  высокочувствительной  видеокамеры  COHU-4922  (COCHU  Inc.,  США)  вводили  в  компьютерную  программно  –  аппаратную  систему  цифрового  анализа  изображения  VIDAS  [12,  13].

Данные  представлены  в  виде  среднего  арифметического  и  стандартной  ошибки  среднего  значения  (М±m).  Результаты  исследования  обработаны  с  использованием  статистического  пакета  лицензионной  программы  «STATISTICA®  forWindows  6.0»  (StatSoftInc.,  №  AXXR712D833214FAN5),  а  также  «Microsoft  Excel  2010».  Статистическую  обработку  проводили  с  применением  t-критерия  Стьюдента  и  U-критерия  Манна-Уитни.  Для  всех  видов  анализа  статистически  значимыми  считали  различия  с  уровнем  значимости  менее  0,05  (95  %)  [4,  с.  173].

Результаты  и  обсуждение

Результаты  проведенных  нами  исследований  показывают,  что  моделирование  нарушения  мозгового  кровообращения  у  крыс  приводит  к  нарушению  тиол-дисульфидного  равновесия,  что  проявляется  уменьшением  пула  восстановленной  формы  глутатиона  (табл.  1).  Так,  в  данных  условиях  отмечается  падение  GSH  начиная  с  1  суток  наблюдения  на  19,4  %,  а  на  4  и  18  сутки  уровень  этого  показателя  снижался  в  5,8  и  8,4  раза  соответственно.  Параллельно  регистрировалось  значительное  нарастание  окисленной  формы  –  уже  через  24  часа  после  окклюзии  сонных  артерий  содержание  дисульфида  глутатиона  составляло  0,29  мкмоль/г  белка,  что  в  2,2  раза  больше  показателя  группы  ложнооперированных  животных.  В  условиях  НМК  окислению  подвергались  не  только  SH-группы  глутатиона,  но  и  других  тиол-содержащих  соединений  (цистеина,  метионина  и  др.),  на  что  указывает  снижение  общего  содержания  SH-групп.  Однако  их  уровень  начинал  достоверно  (p≤0,05)  снижаться  с  4  суток  наблюдения.  Накопление  окисленных  интермедиатов  и  усиление  синтеза  оксида  азота  при  участии  нейрональной,  а  в  более  поздние  сроки  ишемии  и  индуцибельной  NO-синтазы,  вызывает  формирование  окислительного  и  нитрозативного  стресса  в  тканях  мозга.  В  условиях  избытка  NO  и  накопления  АФК  происходит  синтез  пероксинитрита  –  наиболее  токсичного  для  нейронов  деривата  оксида  азота.  Специфическим  маркером  накопления  пероксинитрита  является  нитротирозин.  В  нашем  исследовании  отмечается  повышение  содержания  этого  метаболита  на  29,1  %  уже  на  1  сутки  эксперимента,  дальнейшее  наблюдение  показало  увеличение  маркера  в  3,1  и  4,3  раза  на  4  и  18  сутки  соответственно.  Усиленное  образование  пероксинитрита  тесно  связано,  по  нашему  мнению,  со  смещением  тиол-дисульфидного  равновесия.  Интермедиаты  тиол-дисульфидной  системы  обладают  транспортными  свойствами  в  отношении  оксида  азота,  тем  самым  повышая  его  биодоступность.  Кроме  того,  цистеин,  метионин  и  особенно  глутатион  в  восстановленной  форме  способны  ограничивать  цитотоксичность  высоких  концентраций  NO  и  его  дериватов  путем  образования  нитрозотиолов  [1,  с.  39].

Таблица  1.

Влияние  препаратов  на  показатели  тиолового  статуса  и  содержание  нитротирозина  в  головном  мозге  животных  на  разных  сроках  ишемии

  *  –  p≤0,05  по  отношению  к  животным  с  НМК

В  условиях  проведения  экспериментальной  терапии  препаратами,  которые  содержат  в  своей  структуре  SH-группу,  были  получены  результаты,  что  указывают  на  их  способность  предотвращать  смещение  тиол-дисульфидного  равновесия  (табл.  1). 

Позитивное  влияние  исследуемых  препаратов  на  глутатионовое  звено  тиол-дисульфидной  системы  связано  с  антиоксидантными  свойствами.  Последние  обусловлены  наличием  в  их  структуре  тиольной  группы,  благодаря  которой  препараты  обладают  ярко  выраженными  восстановительными  свойствами  и  способностью  принимать  от  различных  активных  форм  кислорода  электроны,  инактивировать  свободные  радикалы  и  сохранять  уровень  эндогенного  глутатиона.  Сохранность  тиол-дисульфидного  равновесия  способствует  ограничению  цитотоксических  эффектов  NO  и  предотвращает  накопление  нитротирозина  (табл.  1).

С  уровнем  NO  связан  баланс  про-  и  антиапоптических  механизмов  при  оксидативном  стрессе.  В  условиях  избытка  АФК  (в  первую  очередь  пероксинитрита  и  гидроксилрадикала)  окислительной  модификации  подвергаются  антиапоптозные  белки  (bcl-2  и  другие),  а  избыток  NO-радикала  усиливает  синтез  проапоптических  белков  (FAS  и  АРО-1).  При  ишемическом  повреждении  усиливается  экспрессия  провоспалительных  цитокинов  (IL-1,  TNF-α,  HIF-1)  и  факторов,  приводящих  к  транскрипции  NF-κB,  AP-1,  JNK,  которые  опосредованно,  в  частности,  через  активацию  индуцибельной  NO-cинтазы,  еще  больше  усиливают  образование  АФК  [13,  с.  2959]. 

Проведенными  гистоиммунохимическими  исследованиями  установлено,  что  развитие  церебральной  ишемии  на  начальных  этапах  (1  сутки)  сопровождается  гиперэкспрессией  гена  раннего  реагирования  c-fos,  на  что  указывает  повышение  c-fos-позитиных  нейронов  в  7,1  раз  по  сравнению  с  показателем  ложнооперированных  животных.  Рядом  исследований  показано,  что  характер  экспрессии  гена  c-fos  определяет  тип  гибели  нейрона:  апоптоз/некроз.  В  случае  значительного  снижения  гена  c-fos  клетка  погибает  некротически  [9,  с.  864].  Действительно,  нами  установлено,  что  уменьшаение  количества  c-fos-позитиных  нейронов  в  контрольной  группе  животных  на  4  сутки  приводило  к  параллельному  снижению  экспрессии  ингибитора  апоптоза  –  белка  bcl-2  (табл.  2).

Таблица  2.

Экспрессия  белков  c-fos  и  bcl-2  в  СА1-зоне  гиппокампа  крыс  на  разные  сроки  ишемии  на  фоне  терапии  антиоксидантами  (M±m)

  *  –  p≤0,05  по  отношению  к  животным  с  НМК

Так,  количество  bcl-2-позитивных  нейронов  в  нейронах  гиппокампа  в  группе  животных  с  НМК  на  4  сутки  снижалось  в  2,5  раза.  Исходя  из  полученных  данных,  можно  сделать  вывод,  что  характер  экспрессии  гена  c-fos  определяет  дальнейшую  судьбу  клетки.  Гиперэкспрессия  этого  гена  вызывает  значительное  повышение  соответствующего  белка  в  нейрональной  клетке,  который  непосредственно  участвует  в  процессе  фрагментации  ДНК  и  инициации  процессов  апоптотической  гибели  клетки.

Гипоэкспрессия  генов  c-fos  и  bcl-2  в  условиях  НМК  на  фоне  патобиохимических  реакций  оксидативного  стресса  объясняется  срывом  адаптационных  возможностей  клетки,  инактивацией  ферментов  антиоксидантной  защиты  и  нарушением  энергетического  метаболизма.  В  конечном  итоге  клетка  погибает  путем  некроза.Введение  доноров  тиоловых  групп  вызывает  ограничение  гиперэкспрессии  гена  c-fos  в  течении  первых  суток  эксперимента  и  предотвращает  снижение  количества  bcl-2-позитивных  нейронов  на  всех  сроках  наблюдения  (табл.  2).  Основываясь  на  данных,  полученных  нами,  в  отношении  состояния  системы  глутатиона  и  уровня  нитротирозина,  можно  сделать  вывод,  что  соотношение  уровня  NO  и  тиол-дисульфидной  системы  является  фактором,  определяющим  тип  гибели  нейронов  в  условиях  ишемии.  Оксидативный  и  нитрозативный  стресс  смещает  тиол-дисульфидное  равновесие  в  сторону  окисленных  тиолов,  что  вызывает  снижение  биодоступности  NO  и  гибель  нейронов  путем  некроза.  Повышение  уровня  восстановленных  форм  тиолов  и  ограничение  цитотоксичности  дериватов  NO  способствует  переключению  типа  гибели  клеток  на  более  выгодный  –  апоптоз.  В  связи  с  этим,  дефицит  тиолового  редокс-контроля  активности  генов  при  ишемии  может  быть  компенсирован  стабилизирующим  влиянием  препаратов  –  доноров  тиоловых  групп,  и  может  рассматриваться  как  один  из  механизмов  их  протективного  влияния  на  нейроны. 

Список  литературы:

1. Беленичев  И.Ф.,  Черний  В.И.,  Нагорна  Е.А.,  Павлов  С.В.,  Бухтиярова  Н.В.  Нейропротекция  и  нейропластичность  –  Киев:  Логос,  2015.  –  512  С.
2. Калинина  Е.В.  Чернов  Н.Н.,  Новичкова  М.Д.  Роль  глутатиона,  глутатионтрансферазы  и  глутаредоксина  в  регуляции  редокс-зависимых  процессов  //Успехи  биол.наук.  –  2014  –  Т.  54.  –  С.  299–348.
3. Кулинский  В.И.,  Колесниченко  Л.С.,  Шпрах  В.В.,  Варлан  Н.В.,  Бадрымов  В.В.  Изучение  глутатиона  и  ферментов  его  метаболизма  у  больных  старших  возрастных  групп  с  хронической  церебральной  ишемией  //  Бюллетень  ВСНЦ  СО  РАМН.  –  2005.  –  Т.  1(39).  –  С.  63–65.
4. Реброва  О.Ю.  Статистический  анализ  медицинских  данных.  Применение  пакета  прикладных  программ  STATISTICA  /О.Ю.  Реброва  –  М.,  Медиасфера,  2002,  –  312  с.
5. Супрун  Е.В.  Громов  Л.О.  Модуляция  апоптоза  как  необходимое  звено  нейропротекции  //Укр.вісник  психоневрології  –  2011.  –  Т.  19,  –  №  2  (67).  –  С.  120–124.
6. Фармакология:  коллективная  научная  монография;  [под  ред.  В.П.  Волкова].  Новосибирск:  Изд.  «СибАК»,  2013.  –  194  с.
7. Чекман  И.С.,  Губский  Ю.И.,  Беленичев  И.Ф.  Доклиническое  изучение  специфической  активности  потенциальных  нейропротективных  препаратов  –  К.:  ГФЦ  МОЗ  Украины,  2010.  –  81  с.
8. Чистик  Т.В.  Борьба  с  инсультом:  состояние  медицинской  помощи  в  Украине  и  в  мире  //Международный  неврологический  журнал  –  2014  –  №  7  (69)  –  С.  86–93.
9. Cazanave  S.,  Berson  A.,  Haouzi  D.  High  hepatic  glutathione  stores  alleviate  Fas-induced  apoptosis  in  mice  //Journal  of  Hepatology  –  2007  –  Vol.  46  –  P.  858–868.
10. Halliwell  B.  Free  radical  in  Biology  and  Medicine.  –  Oxpord:  Clarendon  Press.  –  1995.  –  345  p.
11. Jang  J.H.,  Surh  Y.J.  Potentiation  of  cellular  antioxidant  capacity  by  Bcl-2:  implications  for  its  antiapoptotic  function  //  Biochemical  Pharmacology  –  2003  –  Vol.  66  –  Р.  1371–1379.
12. Kolesnik  Y.M.,  Abramov  A.V.  Image  analysis  system  for  quantitative  immunofluorescence  measurement  //  Microscopy  and  Analysis.  –  2002.  –  №  5.  –  P.  12–16.
13. Voehringer  D.W.,  McConkey  D.J.,  McDonnell  T.J.,  Brisbay  S.  Bcl-2  expression  causes  redistribution  of  glutathione  to  the  nucleus  //  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  –  1998  –  Vol.  95  –  Р.  2956–2960.