ИССЛЕДОВАНИЯ  ПО  ИДЕНТИФИКАЦИИ  И  ОПРЕДЕЛЕНИЮ  СОДЕРЖАНИЯ  АРБУТИНА  В  УРОЛИТИЧЕСКОМ  РАСТИТЕЛЬНОМ  СБОРЕ

Смыслова  Ольга  Александровна

аспирант  кафедры  фармации  ГБОУ  ВПО  Первого  Московского  государственного  медицинского  университета  им.  И.М.  Сеченова,  РФ,  г.  Москва

Е- mail:  smysolga@rambler.ru

Маркарян  Артем  Александрович

д-р  фарм.  наук,  профессор,  зав.  кафедрой  фармации  ГБОУ  ВПО  Первого  Московского  государственного  медицинского  университета  им.  И. М.  Сеченова,  РФ,  г.  Москва

STUDY  ON  IDENTIFICATION  AND  DETERMINATION  OF  THE  CONTENT  ARBUTIN  IN  THE  UROLITHIC  HERBAL  TEA

Olga  Smyslova

graduate  student  of  pharmacy  I.M.  Sechenov  First  Moscow  State  Medical  University,  Russia,  Moscow

Artem  Markaryan

doctor  of  pharmacy,  professor,  head  of  the  department  of  pharmacy   I.M.  Sechenov  First  Moscow  State  Medical  University,  Russia,  Moscow

АННОТАЦИЯ

Идентификация  арбутина  в  извлечениях  сбора  уролитического  на  основе  листьев  брусники,  травы  хвоща  полевого,  корней  лопуха,  плодов  укропа  огородного,  травы  полыни  обыкновенной,  а  также  разработка  методики  количественного  определения.

Исследования  проводились  физико-химическими  методами  (ТСХ,  ВЭЖХ).

Количественное  содержание  арбутина  колеблется  в  пределах  0,78  %,  при  относительной  ошибке  единичного  определения  с  95  %  вероятностью  ±  2,34  %.

Разработаны  методики  качественного  и  количественного  определения  арбутина  в  уролитическом  сборе.

ABSTRACT

Identification  of  arbutin  in  extracts  of  the  urolithic  collection  based  on  leaves  of  Vaccinium  vitis-idaea  (L.),  herb  of  Equisetum  arvense  (L.),  roots  of  Arctium  lappa  (L.),  fruits  of  Anethum  graveolens  (L.),  and  herb  of  Artemisia  vulgaris  (L.).,  as  well  as  the  development  of  methods  of  quantitative  determination.

Studies  were  carried  out  by  physicochemical  methods  (TLC,  HPLC)/

Quantitative  content  of  arbutin  ranges  from  0.78%,  with  a  relative  error  of  the  determination  at  95  %  probability  of  ±  2,34  %.

The  methods  of  qualitative  and  quantitative  determination  of  arbutin  in  the  urolithic  collection  were  developed.

Ключевые  слова:   арбутин;  ТСХ-метод;  ВЭЖХ-метод;  лекарственный  растительный  сбор;  мочекаменная  болезнь.

Keywords:   arbutin;  TLC;  HPLC;  medicinal  herbal  tea;  urolithiasis.

ВВЕДЕНИЕ

Мочекаменная  болезнь  (МКБ)  по  количеству  больных  занимает  одно  из  первых  мест  в  мире  по  сравнению  с  другими  урологическими  заболеваниями,  в  России  этот  показатель  равен  34,2  %.  Согласно  статистическим  данным  в  65—70  %  случаях  болезнь  диагностируется  у  лиц  в  возрасте  20—55  лет,  т.  е.  в  наиболее  трудоспособном  периоде  жизни.

Не  смотря  на  широкое  внедрение  новых  высокоэффективных  методов  диагностики  и  лечения  МКБ,  частота  рецидива  продолжает  оставаться  высокой  —  до  38,4  %.  Общеизвестно,  что  как  бы  эффективно  не  была  проведена  операция  по  удалению  камня,  без  последующей  комплексной  метафилактики  конечный  результат  лечения  будет  неудовлетворительным.  Одним  из  основных  звеньев  метафилактики  камнеобразования  и  лечения  на  амбулаторном  этапе  является  фитотерапия  [6;  8].

Растительные  средства,  как  правило,  оказывают  мягкое  и  эффективное  лекарственное  воздействие,  практически  отсутствуют  осложнения  и  нежелательные  побочные  эффекты  при  длительном  применении.  Особенно  это  важно  при  такой  хронической  патологии,  как  МКБ,  когда  необходимо  обеспечение  многомесячного  и  даже  многолетнего  диуретического,  спазмолитического,  противовоспалительного,  антибактериального,  иммуномодулирующего  эффекта.  Поэтому  актуальной  задачей  является  поиск  и  изучение  эффективных  средств,  полученных  из  растительного  сырья,  предназначенных  для  профилактики  и  лечения  хронического  течения  МКБ  [3].

  Нами  разработан  многокомпонентный  растительный  сбор  для  лечения  и  профилактики  МКБ  на  основе  листьев  брусники  (Vaccinium  vitis-idaea  (L.),  травы  хвоща  полевого  (Equisetum  arvense  (L.),  корней  лопуха  (Arctium  lappa  (L.) ,  плодов  укропа  огородного  (Anethum  graveolens  (L.),  травы  полыни  обыкновенной  (Artemisia  vulgaris  (L.). 

При  предварительном  фитохимическом  изучении  сбора  было  установлено,  что  одной  из  основных  групп  фенольных  соединений  является  фенологликозид  арбутин.  Арбутин,  содержащийся  в  листьях  брусники  обуславливает  мочегонное  и  антимикробное  действие.  Мочегонное  действие  арбутина  заключается  в  повышении  гломерулярной  фильтрации  и  увеличении  образования  первичной  мочи  вследствие  повышения  почечного  кровотока.  Согласно  экспериментальным  данным  мочегонное  действие  арбутина  реализуется  без  нарушения  водно-солевого  обмена,  в  частности  транспорта  ионов  натрия  и  калия.  При  ферментативном  гидролизе  арбутина  кишечной  палочкой  в  желудочно-кишечном  тракте  высвобождается  гидрохинон,  который  проявляет  антимикробное  действие.  Исследование  противомикробного  эффекта  гидрохинона  показало  его  активность  в  отношении  грамоотрицательных  микроорганизмов,  в  том  числе  и  в  отношении  антибиотикорезистентных  штаммов,  поскольку  растворы  гидрохинона  останавливали  рост  и  размножение  не  только  стандартных,  но  и  клинических  штаммов.  Такое  действие  гидрохинона  может  быть  обусловлено  его  структурой.  Гидрохинон  является  фенолом  и  оказывает  токсический  эффект  на  живые  клетки,  в  том  числе  и  бактериальные.  Окисляясь,  он  превращается  в  бензохинон,  который,  в  свою  очередь,  также  может  оказывать  бактерицидное  действие  на  микроорганизмы.  Комплексное  антимикробное  действие  арбутинсодержащего  лекарственного  растительного  сырья  обусловлено  сочетанием  высокой  активности  действующих  веществ  и  широкого  спектра  их  антимикробного  действия  с  безвредностью  для  человека  в  концентрациях,  достаточных  для  подавления  роста  и  размножения  микроорганизмов  [1;  2;  4].

  Целью  нашей  работы  являлось  определение  арбутина  и  разработка  методики  количественного  определения  фенологликозида  в  сборе,  содержащем  листья  брусники,  траву  хвоща  полевого,  корни  лопуха,  плоды  укропа  огородного,  траву  полыни  обыкновенной.

Материалы  и  методы

Объектом  изучения  являлся  сбор  уролитический  на  основе  листьев  брусники,  травы  хвоща  полевого,  корней  лопуха,  плодов  укропа  огородного,  травы  полыни  обыкновенной.  В  качестве  исследуемых  растворов  использовали  водно-спиртовые  извлечения  данного  уролитического  сбора. 

Для  идентификации  арбутина  применяли  метод  тонкослойной  хроматографии  (ТСХ)  [7].  В  качестве  неподвижной  фазы  использовали  пластины  «Kieselgel  60  F254»  фирмы  «Merk»  размером  15  х  20  см  в  системах  растворителей  муравьиная  кислота-вода-этилацетат  (6:6:88). 

В  качестве  исследуемого  раствора  использовали  извлечения  спиртом  метильным,  полученные  по  следующей  методике:  около  2,5  г  измельчённого  до  порошка  сухого  сырья  помещали  в  колбу  вместимостью  50  мл,  прибавляли  25  мл  смеси  метанол,  вода  в  равных  пропорциях  и  нагревали  с  обратным  холодильником  на  кипящей  водяной  бане  в  течение  10  минут.  Раствор  фильтровали  через  бумажный  фильтр  (испытуемый  раствор). 

В  качестве  растворов  сравнения  использовали  растворы  рабочих  стандартных  образцов  (РСО)  арбутина,  гидрохинона  и  галловой  кислоты  в  метаноле.  Для  этого  по  25  мг  арбутина,  гидрохинона  и  кислоты  галловой  растворяли  в  10  мл  метанола.

На  линию  старта  хроматографической  пластины  наносили  по  20  мкл  испытуемых  растворов  и  10  мкл  растворов  сравнения  арбутина,  гидрохинона  и  галловой  кислоты  в  метаноле.  Пластину  высушивали  на  воздухе  до  полного  улетучивания  растворителей,  затем  ее  помещали  в  камеру  для  хроматографирования  и  хроматографировали  восходящим  способом.  Длина  пробега  растворителей  15  см.

Детекция  зон  адсорбции  вначале  1  %  раствором  дихлорхинонахлоримида  в  метаноле  и  затем  2  %  раствором  натрия  карбоната  безводным  (после  нагревания  при  100—105  °С).

Исходя  из  полученных  данных  по  качественному  составу  исследуемого  объекта  фитокомпозиции  предложена  методика  по  количественной  оценке  арбутина.

Количественное  определение  арбутина  водно-спиртовой  вытяжки  из  сбора  проводили  методом  высокоэффективной  жидкостной  хроматографии  (ВЭЖХ)  [5].

Анализ  проводили  на  высокоэффективном  жидкостном  хроматографе  фирмы  «Gilston»  с  ручным  инжектором  Rheodyne  7125  USA  с  последующей  компьютерной  обработкой  результатов  с  помощью  программы  «Мультихром  для  «Windows».  В  качестве  неподвижной  фазы  была  использована  металлическая  колонка  Kromasil  С18  4,6  x  250  мм,  с  размером  частиц  5  мкн.  В  качестве  подвижной  фазы:  метанол-вода-фосфорная  кислота  концентрированная  (400  :  600  :  5).  Исследование  проводили  при  комнатной  температуре.  Скорость  подачи  элюента  0,8  мл/мин.  Продолжительность  анализа  70  мин.  Детектирование  проводилось  с  помощью  УФ-детектора  «Gilston»  UV/VIS  модель  151,  при  длине  волны  254  нм.  Для  исследования  сырьё  измельчали  до  размера  частиц,  проходящих  сквозь  сито  с  диаметром  отверстий  2  мм  по  ГОСТ  214-83.

Для  получения  исследуемого  раствора  около  10,0  г  растительного  сырья  помещали  в  колбу  вместимостью  150  мл,  прибавляли  по  70  мл  спирта  этилового  70  %,  присоединяли  к  обратному  холодильнику  и  нагревали  на  кипящей  водяной  бане  в  течение  1  часа  с  момента  закипания  спиртоводной  смеси  в  колбе.  После  охлаждения  смесь  фильтровали  через  бумажный  фильтр  в  мерную  колбу  объёмом  100  мл  и  доводили  спиртом  этиловым  70  %  до  метки  (исследуемый  раствор).

Параллельно  готовили  0,05  %  раствор  РСО  арбутина  в  70  %  спирте  этиловом.  Для  этого  около  0,0103  (точная  навеска)  г  арбутина  помещали  в  мерную  колбу  вместимостью  25  мл  растворяли  в  20  мл  спирта  этилового  70  %  и  доводили  тем  же  растворителем  до  метки.

По  50  мкл  исследуемого  раствора  и  раствора  сравнения  вводили  в  хроматограф  и  хроматографировали  по  выше  приведенной  методике. 

Результаты  и  обсуждение

Идентификация  арбутина  методом  хроматографического  анализа  водно-спиртового  извлечения  из  многокомпонентного  растительного  средства  представлена  на  рисунке  1.  После  детектирования  хроматограммы  наблюдали  появление  2-х  зон  голубого  цвета  с  Rf  ~  0,2  (арбутин),  Rf  ~  0,85  (гидрохинон)  и  зоны  коричневого  цвета  с  Rf  ~  0,67  (галловая  кислота).

Рисунок  1.  Схема  хроматограммы  арбутина:  1  —  спиртовое  извлечение  из  уролитического  сбора;  РСО:  2  —  галловой  кислоты;  3  —  арбутина;  4  —  гидрохинона

Расчёт  количественного  содержания  арбутина  производили  методом  абсолютной  калибровки  с  помощью  компьютерной  программы  «Мультихром  для  «Windows»  и  по  формуле:

С  (%)  =  Sис.х  Сст.  х  100  х  100  х  100

S  ст.х  25  х  а  х  (100  -  W)

где:  S  ис.  —  площадь  пика  арбутина  в  исследуемом  растворе;

S  ст.  —  площадь  пика  раствора  РСО  арбутина;

С  (%)  —  концентрация  арбутина  в  %;

С  ст.  —  масса  навески  РСО  арбутина  в  г;

а  —  масса  навески  сбора  в  г.;

W  —  потеря  в  массе  при  высушивании  в  %.

Результаты  проведенных  исследований  количественного  определения  арбутина  в  сборе  уролитическом  приведены  в  таблице  1:

Таблица  1.

Результаты  количественного  определения  арбутина  в  сборе  уролитическом  методом  ВЭЖХ

Метрологические  характеристики  методики  количественного  определения  арбутина  в  спиртовых  извлечениях  из  сбора  уролитического  представлены  в  таблице  2:

Таблица  2.

Метрологические  характеристики  результатов  количественного  определения  арбутина  в  сборе  уролитическом  методом  ВЭЖХ

Относительная  ошибка  методики  определения  содержания  арбутина  с  95  %  вероятностью  составляет  ±  2,34  %.  Согласно  проведенным  исследованиям  фитокомпозиции  количественное  содержание  арбутина  колеблется  в  пределах  0,78  %.

Выводы

1.  Методом  ТСХ  установлено  наличие  арбутина  в  водно-спиртовом  извлечении  фитокомпозиции.

2.  Нами  разработана  методика  количественного  определения  арбутина  с  помощью  метода  ВЭЖХ  в  сборе  уролитическом,  состоящем  из  листьев  брусники,  травы  хвоща  полевого,  корней  лопуха,  плодов  укропа  огородного,  травы  полыни  обыкновенной.

3.  Методом  ВЭЖХ  в  многокомпонентном  растительном  средстве  определено  количественное  содержание  арбутина  составляющего  0,78  %,  при  относительной  ошибке  единичного  определения  с  95  %  вероятностью  ±  2,34  %.

Список   литературы

1.Волобой  Н.Л.,  Бутакова  Л.Ю.,  Смирнов  И.В.  Изучение  антимикробного  действия  арбутина  и  гидрохинона  в  отношении  некоторых  представителей  грамотрицательной  флоры.  //  Химия  растительного  сырья.  —  2013.  —  №  1.  —  С.  179—182.

2.Волобой  Н.Л.,  Смирнов  И.В.,  Бондарев  А.А.  Особенности  мочегонной  активности  арбутина  и  гидрохинона.  //  Сибирский  медицинский  журнал.  —  2012.  —  Т.  27,  —  №  3.  —  С.  131—133.

3.Корсун  В.Ф.,  Корсун  Е.В.,  Суворов  А.П.  Клиническая  фитотерапия  в  урологии.  М.:  МК,  2011.  —  336  с.

4.Моисеев  Д.В.  Определение  арбутина  в  листьях  брусники  обыкновенной  методом  ВЭЖХ  //  Вестник  фармации.  —  2011.  —  №  1.  —  С.  40—45.

5.Потрясай  К.А.,  Копнин  А.А.  и  др.  Количественное  определение  арбутина  в  сырье  рододендрона  золотистого  методом  высокоэффективной  жидкостной  хроматографии  //  Сибирский  медицинский  журнал.  —  2009.  —  №  8.  —  С.  134—138. 

6.Черепанова  Е.В.,  Дзеранов  Н.К.  Метафилактика  мочекаменной  болезни  в  амбулаторных  условиях.  //  Экспериментальная  и  клиническая  урология.  —  2010.  —  №  3.  —  С.  33—39. 

7.European  Pharmacopoeia.  Sixth  edition.  Supplement  6.1.  Strasbourg:  EDQM,  2008.  —  P.  3410—3411.

8.Jyothi  M  Joy,  Prathyusha  S.,  Mohanalakshmi  S.,  AVS  Praveen  Kumar,  CK  Ashok  Kumar.  Potent  herbal  wealth  with  litholytic  activity:  a  review.  //  Int.  J.  of  Innov.  Drug  Disc.  —  2012.  —  Vol.  2,  —  №  2.  —  P.  66—75.