МОДЕЛИ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА НА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Моргун Андрей Васильевич

канд. мед.наук, асс. каф. педиатрии ИПО, КрасГМУ

им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, г. Красноярск

Е-mail: 441682@mail.ru

Малиновская Наталия Александровна

канд. мед. наук, доцент каф. биохимии с курсами мед.,
фарм. и токс. химии,КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, г. Красноярск

Е-mail: reg.kgmu@gmail.com

Окунева Олеся Сергеевна

ассистент каф. биохимии с курсами мед.,
фарм. и токс. химии,КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, г. Красноярск

Е-mail: okunevaolesya@gmail.com

Дробушевская Анна Ивановна

аспирант каф.общей хирургии,КрасГМУ

им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, г. Красноярск

Е-mail: annushkadoc@mail.ru

Кутищева Ирина Александровна

аспирант каф.детских инфекционных болезней с курсом ПО, КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России, г. Красноярск

Е-mail: iria24@mail.ru

Исследование выполнено при поддержке гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых МК-4818.2012.7.

Проблема инсульта остается одной из самых острых проблем современного здравоохранения. Это обусловлено высокой частотой развития данной патологии и значимыми последствиями для пациентов и общества, то есть высоким уровнем инвалидизации и смертности. Значимость инсульта как медико-социальной проблемы растет с каждым годом, что связывают со старением населения, а также с увеличением в популяции числа людей с факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний. В Российской Федерации отмечено увеличение случаев инсульта, в то время как в экономически развитых странах происходит их снижение [1; 3].

Проблемой для фундаментальных исследований патогенеза ишемии головного мозга является невозможность забора материала от пациентов с ишемическими инсультами и поэтому практически полностью отсутствует возможность наблюдения за процессами, протекающими в живых клетках человека при этой патологии. Наиболее приближенными к процессам человеческих клеток являются модели патологии in vivo на животных. Однако при их использовании возникают сложности с воспроизводимостью результатов, трудности содержания чистых линий животных и обоснования использования моделей in vivo перед этическим комитетом.

Поэтому в качестве альтернативных методов замены животных все большее значение приобретают модели на клеточных культурах (модели in vitro), имитирующие процессы, протекающие в живых организмах и максимально приближенные к соответствующим процессам, про-текающим у человека. Так, клеточные культуры является универсальным методом для исследования «физиологических» и патологических явлений, выяснения механизмов передачи сигнала, регуляции экспрессии генов, клеточной пролиферации, а также механизмов их гибели [9, с. 253]. Для нейроисследований в качестве модельных клеток для патологий нервной системы используются главным образом следующие виды кле-ток — нейроны, астроциты и эндотелиоциты, реже перициты, составляющие единую функциональную единицу, первостепенной целью которой является поддержание гомеостаза клеток нервной системы.

В патогенезе ишемии головного мозга in vivo ведущую роль приобретают снижение энергопродукции, угнетение аэробного и активация анаэробного гликолиза, нарушение активного транспорта различных ионов через мембраны, гипоксическое повреждение головного мозга, накопление недоокисленных продуктов углеводного и липидного обмена, гидролиза АТФ и других макроэргических соединений, активация окислительного стресса, глутаматная эксайтотоксичность, опосредованная оксидом азота и активацией NMDA-рецепторов, нарушение сосудисто-тромбоцитарного звена системы гемостаза и усиленная выработка провоспалительных цитокинов [2; 14, с. 119—131; 10, с. 239; 11, с. 780; 18, с. 1384].

Одной из первых моделей создания ишемии головного мозга in vitroявилась модель с нарушением метаболических и электрических функций гиппокампальных слайс-культур. Моделировали 3 варианта ишемии мозга — гиппокампальные слайс-культуры помещали в среду ACSF, лишенную глюкозы и кислорода, на 7 минут, а затем перфузировали в стандартной среде ACSF33 минуты. Второй вариант включал более продолжительный период ишемии — 15 минут. Третий вариант, названный «вторичной ишемией», включал обработку слайс-культур как во втором варианте, но после восстановительного периода слайс-культуры снова подвергались 7-минутной ишемии и восстановительному периоду 33 минуты. Первые два варианта были описаны авторами как постдекапитационная ишемия и лишь третий вариант, «вторичная» ишемия, был назван авторами моделью ишемии мозга in vitro [22, с. 793].

Современные модели ишемии головного мозга включают модели создания гипоксии клеток мозга (модели с депривацией кислорода), модели с депривацией кислорода и одновременного создания других условий (депривация кислорода и глюкозы, депривация кислорода/глюкозы и создание метаболических условий ишемии), а также модели глутаматной эксайтотоксичности и окислительного стресса.

Один из вариантов гипоксии клеток путем кислородной депривации включает помещение чашек с 2-дневной культурой гиппокампальных нейронов со средой TIP/DF, содержащей AraC, в пакет Tedlar bag (фирма Dupont) с бескислородной системой Anaeropack (Mitsubishi Gas Chemical), которая позволяет быстро заменить кислород углекислым газом в пакете. После 5-минутной вентиляции клеток со 100 % азотом, пакет с клетками запечатывали герметично и инкубировали при 37°С в течение 6, 12 и 24 часов. После этого периода вскрывали пакет и помещали чашки с культурами клеток в стандартные условия СО₂-инкубатора и культивировали в течение 2 дней [4, с. 1029]. Второй вариант гипоксии путем лишения кислорода — культура нейрональных клеток B50 подвергалась 9-часовой гипоксии (сбалансированное содержание N₂, 1 % O₂и 5 % CO₂), а затем 24-часовой реоксигенации в полной культуральной среде [20, с. 1336].

Еще один вариант создания гипоксии клеток нервной системы — «сэндвич-модель» гипоксии и метаболического стресса. Для создания модели использовали очищенные матовые предметные стекла, обработанные абсолютным этанолом и помещенные в полистироловую чашку для культивирования клеток. На оба конца стекла наносили небольшое количество водонерастворимого клея. Готовили 2 покровных стекла толщиной 0,2 мм, обрабатывали их абсолютным этанолом и закрепляли на обоих концах предметного стекла с клеем. Перед использованием система находилась в СО₂-инкубаторе. 1 мл 72-часовой культуры человеческих NBклеток с концентрацией 1х10⁵ клеток в среде DMEMпомещался в центр каждой ячейки созданной конструкции. Сформированные системы возвращались в СО₂-инкубатор на 5 часов для адгезии клеток к субстрату на дне конструкции. После этого системы заполнялись 15 мл среды DMEM и ставились в СО₂-инкубатор на 24—36 часов для образования монослоя клеток. Затем культуральную среду отсасывали и на небольшое количество клея или адгезива прикрепляли новые покровные стекла поверх системы, формируя «сэндвич». Щель между нижними и верхними покровными стеклами была равна 0,2 мм, что позволило сформировать в ней градиент питательных веществ и газов. После нанесения верхних стекол систему снова заполняли 15 мл культуральной среды DMEMи возвращали в СО₂-инкубатор на срок до 7 суток [17, с. 289].

Модели кислородно-глюкозной депривации включают изолированное снижение содержания кислорода в среде Dulbecco’s в модификации Eagle с антибиотиками и высоким содержанием глюкозы, а также снижение содержания FBS с 10 % до 1 % (модель гипоксии), или одновременное снижение содержания кислорода и глюкозы в среде при снижении содержания FBS с 10 % до 1 % (модель гипоксии-ишемии), остальные условия содержания клеток были стандартными (условия СО₂-инкубатора). Продолжительность инкубации была различной — 2,4,6 и 8 часов [8, с. 473—474]. Другой вариант кислородно-глюкозной депри-вации — содержание клеток в деоксигенированном агликемическом растворе (DAS) в условиях СО₂-инкубатора с газовым составом воздуха 5 % CO₂, 85 % N₂ и 10 % H₂ в течение 180 минут [19, с. 10292]. Модель кислородно-глюкозной депривации на культуре септо-гиппокампальных нейронов, культивируемых в среде DMEMс 10 % FBS, включала их помещение в раствор Хенкса с низким содержанием глюкозы и культивирование от 1 до 10 минут при содержании газового состава воздуха 95 % N₂/5 % CO₂ [16, с. 1282].

Существуют также модели с сочетанием кислородо-глюкозной депривации и других факторов. Одной из таких моделей является кислородо-глюкозная депривация и комбинация ионов во внеклеточной жидкости (высокая концентрация калия — 70 мМ, низкая концентрация кальция — 0,3 мМ и метаболический ацидоз — рН 6,8), данная модель схожа с изменениями, регистрируемыми при глобальной ишемии головного мозга in vivo [6, с. 2].

Кроме вышеперечисленных, интересна модель ишемии-реперфузии клеток in vitro с применением проточной камеры с параллельными пластинами (PPFC) и аппаратом для перфу­зии клеток. Моделирование ишемии-реперфузии проводилось на 5—7-дневной культуре человеческих эндотелиоцитов микрососудов HMEC-1. Конфлуентная культура подвергалась напряжению сдвига 4 дин/см² под действием ламинарного потока культуральной среды MCDB 131 в течение 24 часов. Далее адаптированные к ламинарному потоку клетки либо подвергались дальнейшему воздействию непрерывного ламинарного потока (4 дин/см²) (нормальная перфузия), либо его прекращению на 0,5 ч или 1 ч с последующей реперфузией (4 дин/см²) в течение 6, 12 или 24 часов (модель ишемии/реперфузии). В статье также рассматривалась усиленная экспрессия провоспалительных цитокинов, хемокинов (ИЛ-6, хемоаттрактантный белок MCP-1) и молекул адгезии (ICAM-1, VCAM-1, E-селектин) при ишемии головного мозга in vitro, которые можно рассматривать как звено патогенеза ишемии клеток головного мозга и как возможные факторы моделирования ишемии головного мозга in vitro [13, с. 422—423].

Одной из первых моделей глутаматной эксайтотоксичности являлась модель с 5—7-дневным приложением 1—2 мМ глутамата к культуре гиппокампальных клеток [5, с. 357]. Другая модель глутаматной эксайтотоксичности осуществлялась на мышиных клетках гиппокампа НТ-22, поддержанных в среде DMEM с 10 % FBS. Экспозиция глутамата в 10 мМ концентрации проводилась в течение 24 часов [23, с. 196]. Другими авторами описана модель глутаматной эксайтотоксичности при приложении различных концентраций глутамата (0,1 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ, 2 мМ, 5 мМ и 10 мМ) к культуре нейрональных клеток N2a, время экспозиции также составляло 24 часа [12, с. 3]. Еще одним вариантом развития эксайтотоксичности клеток является продолжительное («хроническое») приложение низких концентраций глутамата (26—34 μM) в течение 3 месяцев, что вызывало гибель 42 % клеток ретинального ганглия [21, с. 1618].

Модель с окислительным стрессом включала отмывку 2-дневной культуры клеток HeLa S3 в среде F-12 в концентрации 0,5х10⁶ клеток от среды раствором PBS. Затем клетки подвергались воздействию H₂O₂ при 37°С в течение 15 мин в 0,1—0,6 мМ концентрациях и трехкратно промывались холодным раствором PBS [15, с. 1791].

Таким образом, согласно патофизиологическим механизмам повреждения клеток нервной системы при ишемии головного мозга, различают модели ишемии головного мозга на клеточных культурах, связанные с гипоксией, снижением содержания глюкозы (депривацией глюкозы) в среде, окислительным стрессом и глутаматной эксайтотоксичностью. В ближайшей перспективе возможными моделями ишемии головного мозга in vitro могут являться модели с воспроизведением изученных ранее патофизиологических механиз­мов при моделирования ишемии головного мозга — изменением концентрации креатина, лактата, цГМФ, цАМФ [22, с. 797—799], селективным истощением пула нуклеотидов АТФ и ГТФ в межклеточной жидкости [7, c. C1270], усилением экспрессии провоспалительных цитокинов, хемокинов и молекул адгезии (ИЛ-6, MCP-1, ICAM-1, VCAM-1, E-селектин) [13, с. 422—423].

Список литературы:

1. Миронов Н.В. / Н.В. Миронов, В.И. Шмырев, И.И. Горяйнова и др. Первичная и вторичная профилактика ишемических инсультов[Электронный ресурс]. — 2002. — Режим доступа: URL: http://medi.ru/doc/a070190.htm (дата обращения: 2.12.12).
2. Нечипуренко Н.И. Основные патофизиологические механизмы ишемии головного мозга /Н.И. Нечипуренко, И.Д. Пашковская, Ю.И. Мусиенко // Мед.новости. — 2008. — № 1 [Электронный ресурс]. — Режим доступа: URL: http://www.mednovosti.by/journal.aspx?article=767 (дата обращения: 2.12.12).
3. Чуканова Е.И. Проблема ишемического инсульта /Е.И. Чуканова//Мед. вестник. — 2010. — № 18(523) [Электронный ресурс]. — Режим доступа: URL: http://medvestnik.ru/archive/2010/18/3118.html (дата обращения: 2.12.12).
4. Akaneya Y. In Vitro Model of Hypoxia: Basic Fibroblast Growth Factor Can Rescue Cultured CNS Neurons from Oxygen-Deprived Cell Death /Y. Akaneya, Y. Enokido, M. Takahashi et al. //J. Cereb. Blood Flow Metab. — 1993. — № 13. — P. 1029—1032.
5. Choi D.W. Glutamate Neurotoxicity in Cortical Cell Culture /D.W. Choi, M. Maulucci-Gedde, A.R. Kriegstein // J. Neurosci. — 1987. — Vol. 7(2). — P. 357—388.
6. Cronberg T. Ischemic Cell Death in the CNS — applications of a new in vitro model: дис. … докт. наук. — Норвегия, Осло, 2004. — P. 1—63.
7. Dagher P.C. Modeling ischemia in vitro: selective depletion of adenine and guanine nucleotide pools / P.C. Dagher // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. — 2000. — Vol. 279. — P. C1270—C1277.
8. Datta A. Phenotyping of an in Vitro Model of Ischemic Penumbra by iTRAQ-Based Shotgun Quantitative Proteomics /A. Datta, J.E. Park, X. Li et al.//J. Proteome Res. — 2010. — № 9. — P. 472—484.
9. Halliwell B. Critical Review. Hydrogen Peroxide. Ubiquitous in Cell Culture and In vivo? /B. Halliwell, M.V. Clement, J. Ramalingam et al. // IUBMB Life. — 2000. — № 50. — P. 251—257.
10. Huang J. Inflammation in stroke and focal cerebral ischemia /J. Huang, U.M. Upadhyay, R.J. Tamargo //Surg. Neurol. — 2006. — № 66. — P. 232—245.
11. Jin R. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells /R. Jin, G. Yang, G. Li //J. Leukoc. Biol. — 2010. — Vol. 87. — P. 779—789.
12. Lee S.M. Effects of Bee Venom on Glutamate-Induced Toxicity in Neuronal and Glial Cells /S.M. Lee, E.J. Yang, S.-M. Choi et al. // JEBCAM. — 2012, P. 1—9.
13. Lee W.H. A Novel In Vitro Ischemia/reperfusion Injury Model /W.H. Lee, S. Kang, P.P. Vlachos, Y.W. Lee //Arch. Pharm. Res. — 2009. — Vol 32, № 3. — P. 421—429.
14. Love S. Oxidative Stress in Brain Ischemia / S. Love //Brain Pathol. — 1999. — № 9. — P. 119—131.
15. Nakamura J. Micromolar concentrations of hydrogen peroxide induce oxidative DNA lesions more efficiently than millimolar concentrations in mammalian cells /J. Nakamura, E.R. Purvis, J.A. Swenberg //NAR. — 2003. — Vol. 31, № 6. — P. 1790—1795.
16. Newcomb-Fernandez J.K. Concurrent Assessment of Calpain and Caspase-3 Activation After Oxygen–Glucose Deprivation in Primary Septo-Hippocampal Cultures /J.K. Newcomb-Fernandez, X. Zhao, B.R. Pike et al. //J. Cereb. Blood Flow Metab. — 2001. — № 21. — P. 1281—1294.
17. Prabhakaran K. Neuroblastoma Survival and Death: An In Vitro Model of Hypoxia and Metabolic Stress /K. Prabhakaran, D.A. Sampson, J.C. Hoehner // J. Surg. Res. — 2004. — № 116. — P. 288—296.
18. Rossi D.J. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia / D.J. Rossi, J.D. Brady, C. Mohr // Nat. Neurosci. — 2007. — Vol. 10, № 11. — P. 1377—1386.
19. Ruscher K.Erythropoietin Is a Paracrine Mediator of Ischemic Tolerance in the Brain: Evidence from an In Vitro Mode /K. Ruscher, D. Freyer, M. Karsch et al.//J. Neurosci. — 2002. — № 22(23). — P. 10291—10301.
20. Shirley R. Combined intervention strategies in an in vitro model of hypoxia/reoxygenation/ R. Shirley, E.N.J. Ord, C. McCabe et.al. // ISCBFM 2011 — Conference Abstracts. — 2011. — P. 1336.
21. Vorwerk C.K. Chronic Low-Dose Glutamate Is Toxic to Retinal Ganglion Cells. Toxicity Blocked by Memantine /C.K. Vorwerk, S.A. Lipton, D. Zurakowski et al. //IOVS. — 1996. — Vol. 37, № 8. — P. 1618—1624.
22. Whittingham T.S. An in vitro model of ischemia: metabolic and electrical alterations in the hippocampal slice /T.S. Whittingham, W.D. Lust, J.V. Passonneau // J. Neurosci. — 1984. — Vol. 4, № 3. — P. 793—802.
23. Yang S.-H. Testosterone increases neurotoxicity of glutamate in vitro and ischemia-reperfusion injury in an animal model /S.-H. Yang, E. Perez, J. Cutright et al. //J. Appl. Physiol. — 2002. — № 92. — P. 195—201.