ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА АКТИВНОСТЬ ПИРИМИДИН-5-НУКЛЕОТИДАЗЫ В СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЯХ ПЕЧЕНИ КРЫС

Нагиев Эйзутдин Рамазанович

д-р мед. наук, профессор, кафедра общей и биологической химии, ДГМА, г. Махачкала

Магомедова Мадина Алиасхабовна

канд. биол. наук, ассистент, кафедра общей и биологической химии, ДГМА, г. Махачкала

E-mail: 

Как известно, ферментативное дефосфорилирование составляет важный этап деградации нуклеотидов. О высоко активности реакций дефосфорилирования свидетельствует увеличение концентрации нуклеозидов [4, 12]. Основной фермент катаболизма пиримидиновых нуклеозид-монофосфатов — уридинмонофосфата (УМФ) и цитидин­монофосфата (ЦТФ) — пиримидин-5-нуклеотидаза (КФ 3.1,3.5), катали­зирующая гидролитическое дефосфорилирование 5-рибонуклеотидов, в результате которого образуется рибонуклеозид и ортофосфат [5, 11].

Несмотря на важную роль пиримидин-5-нуклеотидазы в обмене пиримидиновых нуклеозидмонофосфатов, ферментативное дефосфо­рилирование уридинмонофосфата и цитидинмонофосфата при воз­действии ионизирующей радиации и физической нагрузки до настоя­щего времени не исследовано.

Вместе с тем, данные литературы свидетельствуют о том, что реак­ции катаболизма пиримидиновых нуклеозиддифосфатов и трифосфатов при лучевой болезни претерпевают значительные изменения [6].

Цель настоящей работы — исследование активности пиримидин-5- нуклеотидазы, дефосфорилирующей уридинмонофосфат (УМФ-аза) и цитидинмонофосфат (ЦМФ-аза) в митохондриях и постмито­хондриальном супернатанте, полученных из клеток печени крыс, подвергшихся воздействию; ионизирующей радиации и физической наг­рузки, несомненно являющейся постоянным сопутствующим фактором радиации при различных авариях на АЭС.

Исследования проводили на белых крысах линии Вистар с массой тела 180—200 г, которых подвергли тотальному однократному облуче­нию γ-квантами [⁶⁰Со] в дозе 6 Гр при помощи телегамматерапев­тической установки «Агат-С»; мощность дозы 0,48 Гр/мин. Экспериментальные животные были разделены на группы: 1. интактные (контроль); 2. животные, облученные в дозе 6 Гр, взяты в опыт через 1 ч, 1 и 3 суток после радиационного воздействия; 3. животные, подвергшиеся только физической нагрузке (бег на тредбане до отказа), взяты в опыт сразу после прекращения физической нагрузки; 4. животные, облученные в дозе 6 Гр и подвергшиеся физической нагрузке через 1 ч, 1 и 3 суток после облучения, взяты в опыт сразу же после прекращения физической нагрузки. Животных декапитировали, все операции получения гомогената и субцеллюлярных фракций производи­ли на холоде. Активность пиримидин-5-нуклеотидазы определяли в митохондриях и в постмитохондриальном супернатанте по приросту неорганического фосфата [10] и рассчитывали на 1 мг белка, количество которого оценивали используя микробиуретовый метод [3]. Митохонд­рии клеток печени получали с помощью метода дифференциального цент­рифугирования [15]. Результаты исследований обрабатывали статисти­чески, используя общепринятые методы вариационной статистики.

Как показали данные проведенных исследований, ионизирующая радиация и физическая нагрузка приводят к значительным наруше­ниям активности пиримидин-5-нуклеотидазы, катализирующей фер­ментативное дефосфорилирование уридинмонофосфата и цитидинмо­нофосфата в субклеточных фракциях печени экспериментальных крыс.

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что чистая физичес­кая нагрузка приводит к усилению УМФ-азной и ЦМФ-азной активности исследуемых фракций. Однако, если для УМФ-азной активности имеет место незначительная тенденция к повышению, то ЦМФ-азная активность почти в два раза превышает контрольные показатели, составляя примерно 180 и 209 % в митохондриях и в супернатанте соответственно.

Воздействие ионизирующей радиации вызывает изменения пиримидин-5-нуклеотидазной активности исследуемых субклеточных фракций печени во времени. В частности, через 1 ч после облучения ЦМФ-азная активность в супернатанте повышается примерно на 45 % по сравнению с контролем; ферментативная активность в митохонд­риях, а также активность УМФ-азы в обеих фракциях претерпевает несущественные изменения. Для изменения ферментативного дефо­сфорилирования пиримидиновых нуклеозид-монофосфатов спустя сутки после облучения закономерно резкое уменьшение УМФ-азной и ЦМФ-азной активности, несколько более выраженное в супернатантах. Через 3 суток после радиационного воздействия насту­пает вторая волна повышения УМФ-азной и ЦМФ-азной активности, причем наиболее резко это выражено в супернатантах (около 216 и 196 % контрольного уровня соответственно).

Ионизирующая радиация и физическая нагрузка вызывают достоверное снижение УМФ-азной и ЦМФ-азной (митохондрии и супернатант) активности через 1 ч после сочетанного воздействия. С течением времени возрастает увеличение УМФ-азной и ЦМФ-азной активности в обеих субклеточных фракциях, наиболее заметное спустя 3 суток после совместного влияния радиации и физической нагрузки. Особенно резкое усиление ферментативной активности наблюдается в постмитохондриальных супернатантах. Так, в частности, если УМФ-азная и ЦМФ-азная активность через 3 суток после воздействия указанных факторов в митохондриях составляет 169 и 174 % уровня в контроле, то в супернатанте эти величины в 2,5—3 раза превышают контрольные показатели.

При сравнении полученных данных относительно ферментативного дефосфорилирования уридинмонофосфата и цитидинмонофосфата в печени отмечены как однотипные, так и специфические черты.

Специфическими представляется резко выраженная активация ЦМФ-азной активности в обеих субклеточных фракциях печени крыс при чистой физической нагрузке по сравнению с активацией УМФ-азной активности. Кроме того, УМФ-азная активность в супернатанте через 1 ч после облучения и физической нагрузки не только не снижается, а в отличие от ЦМФ-азной активности, заметно превышает показатели контроля, составляя около 133 %.

Таблица 1

Активность пиримидин-5-нуклетидазы, дефосфорилирующей уридин- и цитидинмонофосфаты (УМФ-аза и ЦМФ-аза соответственно) в субклеточных фракциях печени крыс, подвергшихся облучению и физической нагрузке (в мкмолях Рi на 1 мг белка; М±m, n=8—10)

* — Разница по сравнению с контролем достоверна, р<0.05

В то же время закономерной в изменениях УМФ-азной и ЦМФ-азной активности является выраженная активация дефосфорилирования уридинмонофосфата и цитидинмонофосфата в сравнительно поздние сроки после облучения и особенно после совместного воздействия облучения и физической нагрузки.

Следует обратить внимание на тот факт, что снижение УМФ-азной и ЦМФ-азной активности совпадает во времени с увеличением коли­чества уридинмонофосфата и цитидинмонофосфата в печени [6, 14], а также в других органах [1, 7] облученных животных.

Результаты наших, а также проведенных ранее [9] исследований свидетельствует о том, что в печени 5-нуклеотидаза более эффективно гидролизует уридинмонофосфат и цитидинмонофосфат, чем гуанидин-монофосфат. Ранее было установлено, что 5-нуклеотидаза печени гидролизует аденинмонофосфат, гуанидинмонофосфат, цитидннмоно­фосфат и уридин-монофосфат с относительной скоростью 100, 52, 105 и 104 % [16, 17], что коррелирует с полученными нами результатами. Следует отметить, что если у интактных крыс уровень пиримидин-5-нуклеотидазной активности в митохондриях печени почти в два раза выше, чем в супернатанте, то после облучения, а также в результате совместного влияния облучения и физической нагрузки эти соотно­шения меняются, и ферментативная активность в супернатанте стано­вится значительно выше, чем таковая в митохондриальной фракции. Особенно это выражено через трое суток после воздействия радиации и физической нагрузки. Вероятно, одной из причин этого являются нарушение структуры мембран и изменение их проницаемости после воздействия радиации [2, 13], а вследствие этого и внутриклеточное перераспределение фермента.

Таким образом, ионизирующая радиация и физическая нагрузка вызывают довольно резкие и устойчивые изменения активности ключе­вого фермента катаболизма уридинмонофосфата и цитидинмонофос­фата. Вероятно, нарушение метаболизма пиримидиновых нуклеотидов является важным звеном в патологических превращениях при сочетан­ном воздействии ионизирующей радиации и максимальной физической нагрузки.

Список литературы:

1. Гешанова Е., Живков В. Влияние на йонизиращата радиация синтеза та de novo на пуриновите и пиримидиновите нуклеотиди в селезенка и через дроб на плъхове // Изв. ин—та общ. и сравн. патол. Бълг. АН. — 1989 — 15. — С. 113—118.
2. Коломийцева И. К., Медведев Б. Н. Роль липидов в радиацион­ном поражении и восстановлении биомембран / Биофизика сложных систем и радиационных нарушений. — М: Наука, 1977. — С. 168—173.
3. Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии. — М.: Высшая школа, 1986. —352 с.
4. Кузин A. M. Молекулярные механизмы биологического действия радиации высоких энергий. — М.: Изд—во АН СССР. — 1979. — 224 с.
5. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке.— М.: Мир, 2002—Т. З.—488 с.
6. Нагиев Э. Р., Литовченко И. Н., Савицкий И. В. Изменение содержания пиримидиновых нуклеозидфосфатов в печени облученных крыс // Укр. биохим. журн. — 1989. — 61, № 1. — С. 89—91.
7. Нагиев Э. Р., Савицкий И. В. Нуклеотидный фонд головного мозга крыс в ранние сроки после общего γ—облучения в абсолютно летальной дозе // Нейрохимия. — 1984. — 3, № 2. — С. 172—177.
8. Нагиев Э. Р., Литовченко И. Н. Исследование катаболизма пиримидиновых нуклеотидов в печени облученных животных // Радиобиология. — 1988. — 28, в. 2. — С. 209 — 213
9. Савицкий И. В. Повышение активности 5—нуклеотидазы и сни­жение гуанилаткиназы в головном мозгу и печени облученных крыс // Укр. биохим. журн. — 1996. — 62, № 2. —С. 109—114.
10. Скулачев В. П. Соотношение окисления и фосфорилирования в дыхательной цепи. — М.: Изд—во АН СССР, 1962. — 152 с.
11. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. Основы биохимии. — М.: Мир, 1986 — Т. 2. — 617 с.
12. Федорова Т. А., Рубачев П. Г., Духовная Э. М. О специфично­сти нуклеозидурии в облученном организме // Бюлл, эксперим. биол. и мед.—1980. — 73, № 10. — С. 42—44.
13. Черкасова Л. С, Мокорева С. И., Пикулев А. Т. Изменение процессов фосфорилирования в митохондриях головного мозга при рентгеновском облучении // Докл. АН БССР. — 1983. — 17, № 4. — С. 372—374.
14. Barbirolli В., Pasquinelli В., Moruzzi M. S. Nucleotidi liberi delfegoto di ratto irradiato con raggi xey // Boll. Soc. Ital. Biol. Sperim. — 1988.— 44, N 3.—P. 197—200.
15. Hogeboom G. H., Sehneider W. С, Pallade G. E. Citochemical studies of mammalian tissues. I Isolation of intact michondria from liver some biochemical properties particulate material // J. Biol. Chem. — 1948. — 172, N 2. — P. 619—635.
16. Lamers I. M., Heyliger С. Е., Panagia V. et al. Properties of 5—nucleotidase in rat heart sarcolemma // Biochem. et biophys. acta. — 1993. — 742, N 3. — P. 568—575.
17. Song С. S., Bodansky O. Purification of 5—nucleotidase from human liver. // Biochem. J. — 1996. — 101, N 1. — P. 5—16.