ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА MDR1 НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕЧЕНИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

INFLUENCE OF EXPRESSION OF MDR1  GENE OF EFFICIENCY  OF TREATMENT OF A BREAST CANCER

Diloram Kadyrova

  doctor of biological sciences, head of the gene test laboratory, institute of bioorganic chemistry of the Academy of Sciences

Uzbekistan, Tashkent,

Landish Isanbaeva

docent. Doctor of Philosophy. Ph.D. Tashkent Institute of Postgraduate Medical Education. Department of Obstetrics Gynecology and Perinatal Medicine,

Uzbekistan, Tashkent

АННОТАЦИЯ

Рак молочной железы (РМЖ) – это наиболее часто встречающийся вид рака со смертельным исходом среди женщин в мире. При выполнении данной работы авторами проведено изучение функциональной активности Р-гликопротеина у больных при раке молочной железы до лечения и после неоадъювантной химиотерапии (НАХТ). На основании полученных

результатов было показано, что 5 больных обладают первичной лекарственной устойчивостью. Было отмечено увеличение уровня экспрессии гена MDR1 после НАХТ у больных с первичной лекарственной устойчивостью, по сравнению с уровнем до лечения. Авторы пришли к выводу, что при высокой функциональной активности Р-гликопротеина больные резистентны к лечению, т.е. плохо отвечают на действие лекарственных препаратов.

ABSTRACT

A breast cancer (BC) is a most often meeting type of cancer with deathamong women in the world. At performing this workauthors have carried out studying of functional activity of the P-glycoproteinat patients at a breast cancer before treatment and after neoadjuvant chemotherapy (NACHT) .On the basis of the received results it has been shownthat 5 patients possess primary medicinal stability.The increaseexpression level of MDR1gene was marked after NACHT at patients with primary medicinal stability, in comparison with level before treatment.Authors have come to a conclusion that at high functional activity of the P-glycoproteinpatientsresistant to treatment, i.e. badly answer effect of medicines.

Ключевые слова: рак молочной железы; Р гликопротеин; ген MDRI;лекарственная устойчивость; пациенты резистентные к лечению.

Keywords: аbreast cancer; P-glycoprotein;MDR1gene; primary medicinal stability; patientsresistant to treatment.

Рак молочной железы – одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин. Статистические данные последних лет свидетельствуют о неуклонном, интенсивном росте заболеваемости и смертности от РМЖ, несмотря на значительный прогресс в лечении заболевания, достигнутый в результате совершенствования хирургических и лекарственных методов. Лечение данной категории больных остается одной из наиболее сложных задач современной онкологии. На сегодняшний день множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам является одной из наиболее важных причин неэффективности терапииРМЖ. Развитие МЛУ, связывают и с плохим ответом на химиотерапию и с плохим прогнозом.Резистентность опухолевых клеток к химиотерапии может быть следствием разнообразных процессов: от снижения внутриклеточной концентрации противоопухолевого препарата, обусловленного активным выведением вещества в межклеточную среду АТФ-зависимым трансмембранным белком Р-гликопротеином, являющимся продуктом гена АВСВ1 или MDR1[5,c.605; 4, с.63],  до нарушения механизмов апоптоза в самих опухолевых клетках (мутация или снижение экспрессии гена р53, нарушающие его проапоптотическую функцию)[2,c.427].

Цель исследования: Определение роли транспортного белка Р-гликопротеина,  продукта экспрессии генаMDR1 в формировании множественной лекарственной устойчивости при лечении злокачественных новообразований молочной железы.

Методы исследования:

Выделение ядерной ДНК из лейкоцитов крови. Все процедуры проводили в стерильных условиях. К 0,5мл периферической крови добавляли 2мл стерильной Н₂О,  пробы инкубировали при комнатной температуре 2 часа. Клетки лейкоцитов осаждали при 3000 об/мин, 4⁰С, в течение 15 мин. Надосадочную жидкость аккуратно удаляли, к осадку желто-красных лейкоцитов добавляли 100 мкл стерильной дистиллированной воды и хранили при –20° С.К суспензии лейкоцитов (1х10⁶) добавляли 1мл лизирующего буфера (100мМ Tris-HCl, рН 7,6; 25мМ ЭДТА рН 8,0; 0,15М NaCl; 1% SDS, 2мМ β-меркаптоэтанол), лизис проводили надо льдом 3 мин. Затем пробы центрифугировали при 3000 об/мин., 4⁰С, 15мин. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1), инкубация 15-20 мин при  покачивании. Пробы центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин, 4⁰С. К супернатанту добавляли хлороформ (1:2), инкубация при покачивании в течение 15-20 мин при 160 об/мин, пробы центрифугированием  при 5000 об./мин, 4⁰С, 10 мин. Супернатант осаждали в 3 кратном объеме 96% этанола в присутствии  3М раствора ацетата натрия рН 5,2, пробы оставляли на ночь при –20⁰С. Препараты ДНК промывали раствором 70%-го этанола. Полученные препараты  ДНК можно хранить при –20⁰С, в течение месяца. Препараты  ДНК/РНК и интактной ДНК анализировали, в 2%-м агарозном геле, содержащем 0,5мкг/мл этидиум бромида. Электрофорез вели 1ч при 100В, гель фотографировали в проходящих лучах УФ.

Обратная транскрипция  (ОТ-ПЦР)

Тотальная РНК из биопсийного материала была получена с использованием кит-набора для выделения РНК из тканей «EZ1 RNA Tissue Mini Kit» (на 48 образцов). Производитель «ИнтерлабСервис», Москва, Россия.  Для получения кДНК на матрице РНК использовали кит-набор «РЕВЕРТА-L», Россия. Реакцию обратной транскрипции проводили по протоколу производителя.

В работе использовали праймеры для гена MDR1, кодирующий белок лекарственной устойчивости P-гликопротеин. В качестве контроля использовали праймеры референтного гена GAPDH. ПЦР проводили на амплификаторе «BioRad» США. До проведения ПЦР, ПЦР продукты хранили при -20⁰С.

Таблица 1.

Последовательность праймеров, использованных в исследованиях

Электрофорез ПЦР продуктов проводили в 2% агарозе в ТАЕ буфере, 100В, 1ч. Затем агарозный гель окрашивали в течение 15 мин в растворе этидиум бромида (0,5мкг/мл). Результаты электрофоретического анализа в геле визуально наблюдали через проходящие лучи УФ на трансиллюминаторе «Bio-Rad». Агарозный гель после электрофореза сканировали на денситометре, который анализирует интенсивность свечения ПЦР-продуктов. Полученное изображение полос обрабатывали с помощью комьютерного денситометра (Gel-Pro-Analizer 4.0).

Результаты и обсуждение.

Главным препятствием в достижении эффективности лечения рака молочной железы  являются врожденная или приобретенная (индуцированная) лекарственная резистентность опухолей. Резистентность может проявляться уже на первых курсах химиотерапии, либо возникать в ходе первоначально успешного лечения. Иными словами, рак молочной железы представляет вариант опухоли, в которой реализуются два типа лекарственной резистентности - врожденной и приобретенной (индуцированной). Этим, объясняется наибольшая изученность рака молочной железы. Данная  «модель»  опухоли, обладающая разнообразием клинических проявлений, позволит получить ответ о клинической значимости Р-гликопротеина.В настоящее время, химиотерапевтическое лечение больных с операбельной формой РМЖ (около 85% всех больных РМЖ) включает помимо операции и системную химиотерапию в двух режимах: предоперационную или неоадъювантную и послеоперационную или адъювантную. Они имеют разные цели и могут отличаться по схемам. Адъювантная химиотерапия (АХТ) - вспомогательное, дополняющее хирургические и лучевые методы, лекарственное лечение. Неоадъювантная химиотерапия (НАХТ) является необходимым компонентом комбинированного лечения женщин с местно-распространенным раком молочной железы. При больших размерах опухоли применение НАХТ позволяет уменьшить объем первичной опухоли, что делает возможным выполнение радикального оперативного вмешательства [1, c.605].В качестве объекта для исследований были использованы образцы биопсийного материала и кровь 78, вновь поступивших пациенток с диагнозом РМЖ, до лечения и после 2 курсов НАХТ. Возраст больных находился в пределах  30 - 76 лет. Диагноз РМЖ у всех больныхбыл морфологически верифицирован. У большинства пациенток была сохранена менструальная функция. Всем больным была назначена НАХТ по стандартной схеме FАС,которая содержалациклофосфан, 5-фторурацил,  доксорубицин. Дополнительно к этой схеме решили добавить препарат таксанового ряда доцетаксел.Сравнивали уровень экспрессии гена MDR1 в опухоли молочной железы до лечения и после операции.Предварительно нами было проведено генотипирование больных по полиморфному маркеру С3435Т гена  MDR1для прогноза индивидуального режима химиотерапии.Генотипирование проводили на основе анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. На рисунке 1 представлена электрофореграмма генотипов по полиморфному маркеру С3435Т гена MDR1.

Рисунок 1. Электрофореграмма рестрикции ПЦР продукта полиморфного маркера С3435Т гена MDR1 ферментом MboI

Дорожки: М – маркер 100bp; 1,2,4,5,6,8 – ТТ генотип, один фрагмент размером 320 п.н.; 3,4 – СТ генотип, два фрагмента с размером 190 и 320 п.н. Электрофорез проводили в 2% агарозе в ТАЕ-буфере, в течение 15мин при 20В затем 1ч при 120В.

Выявлены  генотипы ТТ – устойчивый, СТ –среднеустойчивый к действию лекарственных препаратов.  Из литературных данных известно, что у носителей ТТ - генотипа отмечается высокая экспрессии гена MDR1, что приводитк снижению  концентрации лекарственных препаратов в клетке, в результате чего больной не получает адекватного лечения.Функциональная активность Р-гликопротеина, продукта экспрессии гена MDR1, была изучена при помощи количественной ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени.На рисунке 2 представлены данные по функциональной активности Р-гликопротеина до лечения и после проведенной НАХТ.

У 5 пациенток наблюдалась высокая экспрессия гена MDR1,  эти больные имели устойчивый к химиотерапии ТТ генотип.

Рисунок 2.  Анализ экспрессии гена MDR1

Рисунок 3. Анализ экспрессии гена MDR1

Из данных рисунка видно, что у пациенток, имеющих устойчивый к химиотерапии ТТ-генотип,после леченияотмечается увеличение уровня экспрессиигена MDR1 (больные 2-5,8).У пациенток с объективным клиническим ответом на лечение наблюдается снижение экспрессиигена MDR1 (больные 1,6,7). Нами установлено установлены феномены индивидуального повышения или снижения экспрессии АВС- транспортеров.

Таким образом, нами была установлена и подтверждена связь изменения экспрессии гена MDR1 в процессе лечения рака молочной железы с эффектом НАХТ. На основании, полученных нами результатов, можно придти к заключению об индивидуальном повышении или снижении экспрессии гена MDR1в опухоли молочной железы при проведении химиотерапии и связи с этими изменениями ответа на предоперационную химиотерапию.

Выводы:

1. Проведен анализ экспрессии гена MDR1 при лечении рака молочной железы.
2. Показано, что повышение опухолевой экспрессии гена MDR1в процессе   НАХТ является неблагоприятным прогностическим признаком агрессивности течения заболевания, обусловливает отсутствие ответа на химиотерапию, а снижение экспрессии - хороший ответ на НАХТ.

Список литературы:

1. Загрекова Е.И., Мещеряков А.А. Лекарственное лечение рака молочной железы// Русский медицинский журнал. - 2002. - V. 10, N 14. - P. 605-608.
2. Allen J.D., Schinkel A.H. Multidrug resistance and pharmacological protection mediated by the breast cancer resistance protein //Mol. Cancer Ther. - 2002. - V. 1, N 6. - P. 427-434.
3. Bourdon J.-C., Khoury M.P., Diot A., Baker L., Fernandes K.  p53 mutant breast cancer patients expressing p53 have as good a prognosis as wild-type p53 breast cancer patients // Breast Cancer Res. - 2011. - V. 13. - P. R7.
4. Linn SC, Honkoop AH, Hoekman K, van d, V, Pinedo HM G. p53 and P-glycoprotein are often co-expressed and are associated with poor prognosis in breast cancer// British Journal of Cancer-1996, v. 74.-Р. 63-8.
5. He L, Hao C, Lin B, Wang Y., P-glycoprotein expression in primary breast cancer. //Chinese Medical Sciences Journal. - 1995, v. 10, -Р. 12-5.