ПРИМЕНЕНИЕ СКАВЕНДЖЕРОВ ОКСИДА АЗОТА ПРИ ДЕПРИВАЦИИ СИСТЕМНОГО УРОВНЯ, ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА IN VITRO

APPLICATION OF NITRIC OXIDE SCAVENGERS IN CASE OF DEPRIVATION OF REDUCED GLUTATHIONE SYSTEMIC LEVEL IN VITRO

Svetlana Gorbacheva

рhD, Associate Professor at the Department of Biochemistry and laboratory diagnostics of Zaporozhian state medical university,

Ukraine, Zaporozhye

АННОТАЦИЯ

Исследованиями in vitro установлено, что депривация глутатионового звена тиол-дисульфидной системы вызывала формирование каскада необратимых молекулярно-биохимических нарушений в нейронах. Смещение тиолового редокс-статуса клетки в сторону окисленных интермедиатов способствовало развитию оксидативного стресса, о чем свидетельствовало накопление нитротирозина. Степень выраженности патобиохимических изменений коррелировала с торможением экспрессии белка теплового шока HSP70. Внесение скавенджеров оксида азота – тиотриазолина, тиоцетама, ангиолина и α-липоевой кислоты оказывало модулирующий эффект в отношении функционирования тиол-дисульфидной системы и ограничивало развитие нитрозативного стресса. Сохранность уровня, восстановленного глутатиона предотвращала депрессию белка HSP70 в нейрональных клетках, что подтверждает его важную роль в реализации механизмов эндогенной нейропротекции.

ABSTRACT

Introduction of thiol-disulfide system modulators into the incubating neuronal suspension had a positive effect as regards the studied parameters. The most active preparations in this regard were angioline and tiocetam. At the heart of the molecular and biochemical mechanisms of realization of neuroprotective action of thiol-disulfide system modulators is their ability to restrict nitrosative stress reactions. This fact allows considering the given preparations as scavengers of nitric oxide and its derivatives. By means of the reducing a level of reduced glutathione the investigated preparations take part in realization of endogenous neuroprotection at the expense of the increase of heat shock protein HSP70 expression.

Ключевые слова: оксид азота, глутатион, белки теплового шока, модуляторы тиол-дисульфидной системы

Keywords: nitric oxide, glutathione, heat shock proteins, modulators of thiol-disulfide system

В антиоксидантной защите клеток особое место принадлежит глутатиону и ферментам его метаболизма. Снижение уровня глутатиона в нейронах является одним из ведущих факторов в развитии нейродеструктивных процессов [4, с. 14–16]. Большой интересс, в этом отношении, вызывает направление фармакопротекции, направленное на повышение внутриклеточного уровня, восстановленного глутатиона и исследование его роли в редокс-регуляции жизнедеятельности клетки. Известно, что восстановленный глутатион является нейротрансмиттером и нейромодулятором (в микромолярных концентрациях является агонистом глутаматных рецепторов; в миллимолярных концентрациях модулирует SH–группы NMDA рецепторов). Окисленные формы глутатиона в концентрациях свыше 200 мкМ снижают экспрессию генов раннего реагирования, а в концентрации 5 мМ и более активируют р53-зависмый апоптоз и снижают уровень белка теплового шока HSP70 [2, с. 315–317]. Однако, попытки повысить уровень глутатиона путем введения его как в чистом виде, так и в виде эфиров, не нашли широкого применения в связи с получением разнонаправленных и противоречивых данных [7, с. 145–150].

В настоящее время доказана роль тиоловых соединений в механизмах ограничения нитрозативного стресса и повышения биодоступности оксида азота. Благодаря наличию в своей структуре SH-групп, модуляторы тиол-дисульфидной системы обладают свойствами скавенджеров («ловушек») активных дериватов оксида азота. К этой группе препаратов относят тиотриазолин, тиоцетам, метионин, унитиол, глутатион, препараты липоевой кислоты (берлитион). Целым рядом исследований доказана их нейропротективная активность на разных экспериментальных моделях церебральной ишемии [1, с. 124–129]. Однако молекулярные механизмы их положительного влияния на нейроны в условиях окислительного стресса изучены недостаточно. Это указывает на перспективность дальнейшего изучения молекулярно-биохимических механизмов участия глутатиона в регуляции редокс-статуса и процессах эндогенной нейропластичности.

Целью исследования является выяснение роли глутатиона в реализации механизмов эндогенной нейропротеции в условиях дисбаланса тиол-дисульфидной системы in vitro и на фоне применения скавенджеров оксида азота.

Материалы и методы.

Для исследований in vitro нейроны выделяли из коры головного мозга беспородных крысят. Для получения нейронов животных декапитировали и быстро извлекали мозг. Ткани головного мозга измельчали и переносили в раствор, содержащий 7,5 % поливинилпирролидона (ПВП), 1 % бычий сывороточный альбумин (БСА) и 10 ммоль/л СаСl₂. Полученную суспензию фильтровали под незначительным давлением для уменьшения потерь нейрональных клеток. Для грубой очистки использовали тефлоновую воронку с двумя тефлоновыми ситами – 258 мкм и 82 мкм. Последующее фильтрование проводили через металлическое сито с диаметром пор 58 мкм. После последовательного пропускания через сита клеточную суспензию наслаивали на градиент, состоящий из 30 % фиккола, 1,2 М и 1,65 М сахарозы. Центрифугирование проводяли при 60000 g в течение 15 мин (при t +10°С) в рефрежераторной центрифуге SIGMA 3-30K. В результате центрифугирования получали два слоя и плотный осадок. Верхний слой был представлен остатками миелиновых оболочек, второй слой состоял из глиальных и нейрональных клеток. В исследованиях использовали осадок, который был представлен телами нейронов со степенью чистоты 90 %. Выделенные нейрональные клетки отмывали от сахарозы и альбумина охлажденным физиологическим раствором (температура раствора +4⁰С) и ресуспендировали в 0,25 М сахарозе [5, с. 35–37].

Для смещения тиол-дисульфидного равновесия в инкубационную среду вносили окисленный глутатион в дозе 5 ммоль [9, с. 22]. После внесения инициирующего агента образцы инкубировали 60 мин при температуре 37⁰С, так как предыдущими исследования установлено, что именно на этом сроке наблюдения развиваются наиболее выраженные патобиохимические изменения [1, с. 124–129]. В качестве скавенджеров оксида азота использовали тиотриазолин («Артериум», Украина), ангиолин («Фарматрон», Украина), тиоцетам (АО «Галичфарм», Украина), липоевую кислоту («Марбиофарм», Россия), которые вносили в дозе 0,1 мкмоль/л за 30 мин до добавления, окисленного глутатиона.

Для подтверждения депривации системного уровня, восстановленного глутатиона определяли его содержание в реакции с о-фталевым ангидридом [9, с. 44]. Выраженность оксидативного стресса в нейрональной суспензии оценивали по накоплению нитротирозина, который определяли иммуноферментным методом с использованием стандартного тест-набора “Nitrotirosine ELISA Kit” (“HyCult biotechnology”, Нидерланды) в соответствии с прилагаемой к набору инструкции. Количество дегенеративно измененных клеток определяли по окраске препаратов нитритом серебра [3, с. 235].

Концентрацию белка теплового шока HSP70 определяли методом вестерн-блот анализа. Белки разделяли в 10 % полиакриламидном геле (ПААГ). Белки с геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану при напряжении 100 V и силе тока 0,35 А в течение 1 ч. После переноса мембрану помещали в блокирующий буфер, содержащий 1 % раствор бычьего сывороточного альбумина (SIGMA, USA) на 20 часов. Отмытую в растворе 0,1 М фосфатного буфера мембрану помещали в раствор первичных антител против HSP70 (1:500) (Santa Cruz Biotechnology) и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. После проводили повторное промывание в 0,1 М фосфатном буфере, помещали мембрану в раствор вторичных антител (1:1000) (биотинилированный анти-мышиный IgG, SIGMA, USA) и инкубировали 2 часа. Для визуализации мембрану обрабатывали раствором AЭK: 1 таблетка 3-амино-9-этилкарбазола (Sigma, USA), растворенная в 2,5 мл ДМФА, содержащий 47,5 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН 5,0, 25 мкл 30 % Н₂О₂. Инкубировали мембрану в субстратной смеси 5–10 мин. Красный нерастворимый преципитат характеризует комплекс антиген-антитело. Промывали мембрану в дистиллированной воде несколько раз. Высушивали полоски между листами фильтровальной бумаги под потоком холодного воздуха. Детекцию HSP70 осуществляли при помощи денситометрии в программе Adobe Photoshop [9, с. 68].

Результаты исследования обработаны с использованием статистического пакета лицензионной программы “STATISTICA® forWindows 6.0” (StatSoftInc, № AXXR712D833214FAN5), а также “Microsoft Excel 2010”. Статистическую обработку проводили с применением непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Для всех видов анализа статистически значимыми считали различия с уровнем значимости менее 0,05 (95 %) [6, с. 129].

Результаты исследований.

Исследования in vitro показали, что введение в инкубационную среду окисленного глутатиона (GSSG), приводило к выраженному нарушению клеточных молекулярно-биохимических процессов. Как видно из табл., внесение GSSG в нейрональную суспензию сопровождалось дисбалансом тиол-дисульфидной системы, что выражалось в падении уровня, восстановленного глутатиона (GSH) – через 60 мин после внесения GSSG его концентрация снижалась в среднем в 3 раза относительно показателей интактной серии. Параллельно со смещением тиол-дисульфидного равновесия регистрировалась интенсификация процессов свободно-радикального окисления, о чем свидетельствует увеличение маркера окислительного повреждения белков – нитротирозина на 81,2 %. Патобиохимические сдвиги в нейронах происходили на фоне изменения синтеза фактора эндогенной цитопротекции – белка теплового шока HSP70 (табл. 1). Депрессия экспрессии HSP70, вызванная падением восстановленного глутатиона, вызывала запуск механизмов апоптотической и некротической гибели нейронов [10, с. 2645–2650], что выражалось увеличением количества клеток, окрашенных нитритом серебра в 4,4 раза относительно показателя интактной серии (рис. 1).

Рисунок 1. Влияние скавенджеров NO на количество дегенеративно измененных нейронов в разных экспериментальных сериях

где: GSSG – суспензия с внесением окисленного глутатиона; ттз – тиотриазолин; тц – тиоцетам; анг – ангиолин; ЛК – липоевая кислота.

Внесение в инкубационную нейрональную суспензию модуляторов тиол-дисульфидной системы оказывало положительный эффект в отношении изученных показателей (табл.). Наиболее активными в этом отношении были ангиолин и тиоцетам. Преинкубация нейронов с ангиолином предупреждала накопление нитротирозина на 50 % и торможение экспрессии HSP70 в 2,3 раза, что протекало на фоне повышенного в 2,6 раза уровня, восстановленного глутатиона. Тиоцетам опосредованно, восстанавливая пул GSH, повышал уровень HSP70 в 2 раза по сравнению с контрольной суспензией. Повышение уровня эндогенного нейропротектора HSP70 под влиянием использованных препаратов, по-видимому, является важным фактором поддержания жизнеспособности нейронов, что подтверждается снижением количества клеток с дегенеративными изменениями (диаграмма). Внесение тиотриазолина и α-липоевой кислоты проявлялось схожим по направленности, но менее выраженным модулирующим действием на состояние глутатионовой системы и экспрессию HSP70.

Таблица 1.

Содержание восстановленного глутатиона, нитротирозина и белка HSP₇₀ в суспензии нейронов при депривации системы глутатиона

Примечание: * – p<0,05 относительно интактной серии

* – p<0,05 относительно серии с внесением окисленного глутатиона (GSSG)

Некоторыми исследованиями показано, что экспрессия HSP70 регулируется уровнем восстановленного глутатиона. При формировании окислительного стресса увеличение внутриклеточного уровня цитотоксических концентраций активных форм азота и кислорода, а также связанное с этим смещение тиолового редокс-статуса могут быть связаны с депривацией HSP 70 [8, с. 781–784]. Повышение функциональности тиол-дисульфидной системы, наблюдаемое при внесении исследуемых препаратов, в условиях оксидативного стресса способствует повышению биодоступности оксида азота, а также уменьшает цитотоксичность его активных дериватов, что проявлялось в виде снижения уровня нитротирозина. Это указывает на целесообразность применения скавенджеров оксида азота в условиях дисбаланса системы глутатиона.

Таким образом, исследованиями in vitro установлено, что депривация глутатионового звена тиол-дисульфидной системы приводила к необратимым молекулярно-биохимическим нарушениям в нейрональных клетках. Установлено, что степень выраженности данных нарушений коррелировала с изменением экспрессии HSP белка. В основе молекулярно-биохимических механизмов реализации нейропротективного действия использованных препаратов лежит их способность ограничивать реакции нитрозативного стресса и, опосредованно, через сохранность уровня эндогенного глутатиона, участвовать в реализации эндогенной нейропротекции за счет повышения экспрессии белка теплового шока HSP70.

Список литературы:

1. Горбачева С.В., Беленичев И.Ф. Антиоксидантная модуляция нейроапоптоза в условиях дисбаланса тиол-дисульфидной системы и накоплении окисленных промежуточных соединений in vitro // Вісник проблем біології та медицини – 2015 – № 3 – С. 124–129.
2. Калинина Е.В., Чернов Н.Н., Новичкова М.Д. Роль глутатиона, глутатионтрансферазы и глутаредоксина в регуляции редокс-зависимых процессов // Успехи биол.наук. – 2014 – Т. 54. – С. 299–348.
3. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. – М.: Мир. – 1969 – 640 с.
4. Мартынов М.Ю., Ясаманова А.Н., Колесникова Т.И. Окислительный стресс у больных с мозговым инсультом // Consilium Medicum. Неврология. – 2010. – № 2. – С. 14–17.
5. Прохорова М.И. Современные методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) – Л.: Изд-во Ленинградского университета. – 1982. – 272 с.
6. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA – М., Медиасфера, 2002, 312 с.
7. Сотникова Г.В. Значение системы глутатиона для толерантности к полной ишемии головного мозга. Дисс. … к.биол.н., Иркутск, 2003. – 176 с.
8. Тапбергенов С.О., Бекбосынова Б.С., Советов С.М. Функциональное состояние компонентов белков теплового шока, глутатионредуктазы и глутатионовой редокс-системы при нагревании и охлаждении. // Успехи соврем.естествознания. – 2015. – № 1. – С. 781–784.
9. Чекман И.С., Губский Ю.И., Беленичев И.Ф. Доклиническое изучение специфической активности потенциальных нейропротективных препаратов. – К.: ГФЦ МОЗ Украины, 2010. – 81 с.
10. Beere H.M. The stress of dying: the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis // J. Cell Sci. – 2004. – 117. – P. 2641–2651.