РАЗРАБОТКА ТЕХНОДИАГНОСТИКУМОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ НА ОСНОВЕ МЕТОДА ИММУНО-ПЦР

Козырь Арина Владимировна

канд. биол. наук, ст. науч. сотр., ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск

E-mail: 

Хлынцева Анна Евгеньевна

науч. сотр., ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск

E-mail: 

Колесников Александр Владимирович

канд. биол. наук, вед. науч. сотр., ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск

E-mail: pfu2000@mail.ru

Шемякин Игорь Георгиевич

д-р биол. наук, проф., зам.директора, ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск

E-mail: shemyakin@obolensk.org

Современные нужды здравоохранения и контроля за качеством продуктов питания выдвигают высокие требования к чувствитель­ности и специфичности применяемых систем детекции возбудителей бактериаль­ных инфекций. Наиболее остро задача разработки высоко­чувствительных тест-систем стоит в сфере разработки диагностикумов особо-опасных инфекций, таких как чума, холера, сибирская язва, туляремия и особо-опасные кишечные инфекции. Несмотря на то, что благодаря развитию здравоохранения, массовые эпидемии данных за­болеваний давно ушли в прошлое, небольшие локальные вспышки данных инфекций случаются на территории России практически еже­годно. В частности, по данным Роспотребнадзора в 2010 году сибирс­кая язва была выявлена 22 раза (в 2009 году — всего 1 случай), а забо­леваемость туляремией выросла почти в 2 раза, составив в 2010 году 115 случаев [1].

Долгое время недостаточное внимание в мире уделялось контролю за особо опасными кишечными инфекциями, такими, напри­мер, как энтерогеморрагический штамм EscherichiacoliO157:H7. Летом 2011 года в Европе произошла вспышка распространения эволюционировавших высокопатогенных бактерий Escherichiacoliдругого энтерогеморра­гического штамма O104:H4, вызвавшего пище­вые отравления в Германии, а также в ряде других европейских стран, которая привела к заболеванию более 4000 человек [3]. В связи с высо­кой опасностью поражений, вызываемых данными возбудите­лями, постановлением Роспотребнадзора № 86 от 29.06.2011 штаммы Escherichia coli O157:H7, O104:H4 и другие серотипы — продуценты веротоксина были отнесены ко IIгруппе патогенности [2]. Ранняя идентификация подобных возбудителей и организация мониторинга их распространения способствует своевременному началу противоэпиде­мических мероприятий и эффективному выбору средств антибак­териальной терапии.

Особую тревогу вызывает возможность распространения мо­дифицированных и эволюционировавших форм возбудителей особо-опасных инфекций, особенно обладающих мульти резистентностью к типичным антибиотикам первого выбора. Устойчивость к антибио­тикам, обусловленная наличием эписомных генетических детерми­нант, может передаваться в рамках широкого видового спектра бакте­риальных возбудителей инфекционных заболеваний путем горизон­тального переноса. Например, идентифицированная в 2008 г. у больного пневмонией, вызванной Klebsiellapneumoniae,металло-бета-лактамаза «NewDelhi» обеспечивает устойчивость микроорганизма-хозяина к широкому спектру карбапенемов и цефалоспоринов [10]. Ген металло-бета-лактамазы NDM-1 находится в составе плазмиды, которая позже была выявлена у различных патогенных микроорганиз­мов, включая представителей родов Escherichia, Enterobacteria­ceae [5, 9]. Полная резистентность таких патогенов к любым бета-лак­тамным антибиотикам и нечувствительность к ингибитору бета-лактамаз, клаулановой кислоте, делают инфекцию патогенами, проду­цирующими NDM-1, опасной для жизни. Таким образом, разработка новых универсальных, высокоэффек­тивных и чувствительных спосо­бов ранней диагностики опасных бактериальных инфекций представ­ляет собой актуальную задачу современного здравоохранения.

На данный момент большинство применяемых в клинической практике тест-систем для этиологической расшифровки особо опасных инфекций основано на классических микробиологических методах, методах иммуноферментного анализа или ПЦР-диагностике. Взятые в совокупности, данные подходы достаточно эффективны, однако, каж­дый из этих методов детекции возбудителей имеет определённые не­достатки. В частности, микробиологическое определение микроорга­низма требует большого времени на его выращивание и работу в условиях повышенного уровня биобезопасности. Традиционный имму­ноферментный анализ недостаточно чувствителен для проведения экспресс-диагностики на ранних стадиях инфекции и быстрой этиологической расшифровки патогена, поскольку детектирует не менее 1—10 нг белка патогена, что значительно превышает летальную дозу многих бактериальных токсинов. ПЦР-диагностика является весьма чувствительным и специфичным методом анализа, тем не менее клинические образцы или образцы, включающие частицы пищи, почвы и прочие примеси, содержат также ингибиторы ПЦР, родствен­ные микроорганизмы, неспецифическую ДНК, способную дать ложно­положительный сигнал. Кроме того, ПЦР не применима для детекции патогенных микроорганизмов в сложных комплексных средах, напри­мер, при анализе продуктов питания, поскольку в данном случае тре­буется обогащение детектируемых мишеней (аналитов) в образце с применением аффинных меток или селективных сред, что значительно увеличивает время детекции. Наконец, ПЦР может определить только наличие ДНК патогена, но не присутствие, к примеру, сибиреязвен­ного токсина. Дифференциация на токсигенные и не опасные для жиз­ни штаммы методом ПЦР в ряде случаев затруднена или даже невозможна.

Разработанная технология высокоэффективных диагностикумов базируется на методе иммуно-ПЦР, который объединяет в себе преиму­щества избирательности иммунологической идентификации мишени за счет ее связывания со специфическим антителом и высокой чувстви­тельности ПЦР-детекции [7]. В области диагностики бакте­риальных инфекций стратегии иммуно-ПЦР применялись для получе­ния систем детекции сальмонелл [8], энтеротоксина стафило­кокков [4], шига-токсинов [6] и др.

Преимуществами метода иммуно-ПЦР для диагностики возбуди­телей опасных инфекций являются: высокая чувствительность, позво­лящая провести определение возбудителя и секретируемых им патоге­нов на ранних стадиях инфекции; высокий уровень совместимости со стандартными технологиями ИФА и ПЦР, применяемымы в клини­ческой практике; высокая специфичность детекции, обеспечиваю­щаяся приме­нен­ным принципом иммунодетекции; низкая вероятность получения ложноположительных сигналов по сравнению со стандарт­ными методами ПЦР-диагностики; возможность проведения быстрого анализа большого количества образцов; дешевизна большинства используемых в анализе материалов и возможность быстрой экстра­поляции разработанного способа для детекции любых патогенных и непатогенных молекул при существовании эффективной пары детекти­рующих антител.

Разработанный диагностический метод включает в себя этапы иммобилизации антитела на парамагнитных частицах, блокировки поверхности частиц для предотвращения неспецифического связыва­ния антигена и ДНК-матрицы, использованной при детекции, нанесе­ние образцов, содержащих антиген, узнавание антигена детектирую­щим биотинилированным антителом, детекция комплекса антиген-детекти­рующее антитело коньюгатом ДНК с нейтравидином и поста­новка реакции ПЦР в режиме реального времени, эффективность про­хождения которой зависит от количества ДНК, связанной в составе образовавшегося комплекса. Схема этапов проведения детекции при­ведена на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема проведения детекции бактериальных антигенов по методу иммуно-ПЦР.

На первом этапе разработки технологии был определен формат создания тест-систем. Технология иммуно-ПЦР предполагает иммоби­лизацию первого (связывающего) антитела на твердой фазе.Нами было проведено сравнение эффективности применения в качестве твердой фазы иммунологических планшетов и парамаг­нитных частиц, покрытых белком Gбактерий рода Streptococcus,которые позволяют иммобилизовать на поверхности частиц антитело к специфическому антигену, провести его связывание из жидких образцов, избавиться от содержащихся в образцах загрязнений на ранних этапах эксперимента и провести отделениеДНК-матрицы, применяемой для конечной ПЦР-амплификации, от других компо­нентов детекционного комплекса.

Экспериментальные результаты показали, что применение пара­магнитных частиц способствует сокращению времени эксперимента и снижению ложноположительного сигнала в реакции ПЦР-амплифика­ции. Дальнейшее снижение фонового уровня сигнала было достигнуто за счет применения блокировки поверхности парамагнитных частиц раствором Денхардта, содержащим чужеродную ДНК (ДНК спермы лосося). Эффективность блокировки поверхности частиц при помощи данного раствора оказалась выше, чем при блокировке поверхности раствором бычьего сывороточного альбумина, казеина и другими блокировочными агентами, применяемыми в иммунодетекции.

Связывание ДНК в данной системе осуществлялось за счет взаимо­действия биотинилированного детектирующего антитела с биотинили­рованной ДНК через молекулярные мостики, образованные тетравалент­ным белком нейтравидина. В качестве детектируемой матрицы для проведения ПЦР в режиме реального времени был последовательность ДНК, кодирующая фактор элонгации трансляции и встречающаяся в геноме организма Fusarium avenaceum, гриба, являющегося паразитом сельскохозяйственных культур. Вероятность нахождения такой ДНК в клинических образцах крайне низка. Последовательность ДНК была оптимизирована для проведения ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени, что дополнительно снижало вероятность возник­новения ложноположительного сигнала при детекции и позволило существенно повысить чувствительность метода. Контроль за прохождением реакции ПЦР в режиме реального времени осуществ­лялся по методу TaqManс применением специфических праймеров к последовательности и флюоресцентного зонда.

Эффективность детекции с использованием разработанной техно­ло­гии удалось существенно повысить применением нековалентного конью­гата ДНК с нейтравидином, который представляет собой пространст­венную молекулярную «сетку», образованную за счет взаимодействия биотина, находящегося на 5-ти концах двух цепочечного фрагмента ДНК с тетравалетной молекулой нейтравидина. Наиболее эффек­тив­ным является формирование таких комплексов в эквимолярном соотношении биотини­лированной ДНК к белку нейтравидина. Нейтра­видин является производ­ным белка авидина, характеризую­щимся высокой специфич­ностью и эффективностью взаимодействия с биотином. Применение молекулярной «сетки» вместо несвязанных фрагментов биоти­ни­лиро­ванной ДНК повышало количество ДНК-матрицы, удержи­вае­мой единич­ной молекулой антитела, и более чем в 10 раз увеличивало чувстви­тельность метода. Параметры чувстви­тельности детекции бакте­риаль­ных антигенов с использованием техно­логии иммуно-ПЦР достигали 1 пг белка на 1 мл жидкого образца. Типичные результаты реакции ПЦР-амплификации в режиме реаль­ного времени приведены на рисунке 2.

Рисунок 2. Результаты измерения флюоресценции по методу TaqMan в реакции ПЦР-амплификации в режиме реального времени при определении белка летального фактора сибирской язвы методом иммуно-ПЦР. По вертикальной оси изложены значения флюоресценции в единицах, по горизонтальной оси представлено количество циклов ПЦР-амплификации. Кривая 1 — положительный контроль (образец с концентрацией LF 10 pM), кривая 2 — отрицательный контроль (образец не содержащий LF), кривая 3 — отрицательный контроль (ПЦР-реакция проведена без эксперименального образца), кривые 4—49— экспериментальные образцы с различным содержанием LF.

Разработанная технология может быть переведена в формат тест-системы как с использованием моноклональных антител к различным эпитопам детектируемого антигена, так и с применением специфичес­ких поликлональных антител.

Апробация разработанной технологии бактериальных инфекций на базе иммуно-ПЦР проводилась для детекции таких особо-опасных патогенов, как протективный антиген и летальный фактор сибирской язвы, ботулотоксины, шига-токсины, для диагностики инфекции энтерогеморрагической EscherichiacoliO157:H7, Listeriamonocytogensis, Pseudomonasaeruginosa. Эффективность технологии создания тест-систем на основе иммуно-ПЦР была подтверждена в межлабораторных испытаниях, проведенных на базе НИИПЧИ Роспотребнадзора (Иркутск). Таким образом, разработанная стратегия создания диагностикумов на базе иммуно-ПЦР может использоваться в целях получения диагностических тест-систем для нужд практического здравоохранения и контроля за окружающей средой и продуктами питания.

Список литературы:

1. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь—декабрь 2010 года. [Электронный ресурс]: Официальный сайт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ. URL: http://rospotrebnadzor.ru/epidemiologic_situation(дата обращения 25.02.2012).
2. Постановление Главного санитарного врача РФ от 29 Июня 2011 г. N 86 "Об утверждении Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2885 - 11 «Дополнения и изменения N 2 к СП 1.3.2322 — 08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (вместе с «СП 1.3.2885 - 11...») (Зарегистрировано в Минюсте РФ 12.07.2011 N 21317). [Электронный ресурс]: URL: http://base.consultant.ru/cons/cgi online.cgi?req=doc;base=LAW;n=116877 (дата обращения 25.02.2012).
3. EFSA publishes report from its Task Force on the E. coliO104:H4 outbreaks in Germany and France in 2011 and makes further recommendations to protect consumers. [Электронныйресурс]: Пресс-релизEuropean Food Safety Authority. 05.07.2011. URL: http://www.efsa.europa.eu/en/press/news/110705.htm(датаобращения25.02.2012).
4. Fischer A., von Eiff C., Kuczius T., Omoe K., Peters G., Becker K. A quantita­tive real-time immuno-PCR approach for detection of staphylococcal enteroto­xins. // J. Mol. Med. (Berl).— 2007. — V. 85. — № 5. — P. 461—469.
5. Gaibani P., Ambretti S., Berlingeri A, Cordovana M., Farruggia P., Panico M., Landini M. P., Sambri V. Outbreak of NDM-1-producing Enterobacteriaceae in northern Italy, July to August 2011. // Euro Surveill.— 2011. — V. 16. — № 47. — P. 20027.
6. He X., Qi W., Quiñones B., McMahon S., Cooley M., Mandrell R.E. Sensitive detection of Shiga Toxin 2 and some of its variants in environmental samples by a novel immuno-PCR assay. // Appl. Environ. Microbiol. — 2011. — V. 77. — № 11. — P. 3558—3564.
7. Sano T., Smith C. L., Cantor C. R. Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. // Science. — 1992. — V. 258. — № 5079. — P. 120—122.
8. Widjojoatmodjo M. N., Fluit A. C., Torensma R., Verdonk G. P., Verhoef J. The magnetic immuno polymerase chain reaction assay for direct detection of salmonellae in fecal samples. // J. Clin. Microbiol. — 1992. — V. 30. — № 12. — P. 3195—3199.
9. Yamamoto T., Takano T., Iwao Y., Hishinuma A. Emergence of NDM-1-positive capsulated Escherichia coli with high resistance to serum killing in Japan. // J. Infect. Chemother. — 2011. — V. 17. — № 3. — P. 435—439.
10. Yong D., Toleman M. A., Giske C. G., Cho H. S., Sundman K., Lee K., Walsh T. R. Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla (NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. // Antimicrob Agents Chemother.— 2009. — V. 53. — № 12. — P. 5046—5054.