РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА И КОНТРОЛЯ КАЛОГЕНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ И РОДАХ

Захвалинский Василий Сергеевич

к.ф.-м.н., доцент НИУ «БелГУ», г. Белгород

E-mail: zakhvalinskii@bsu.edu.ru

Плигина Ольга Олеговна

студентка НИУ «БелГУ», г. Белгород

E-mail: olgapligina@gmail.com

Существующие методы анализа содержания калогенолитических ферментов в амниотической жидкости являются в основном биохимическими с длительностью от дней до недель и не охватывают весь спектр калогенолитических ферментов. При патологическом течении беременности скорость, точность и полнота анализа является крайне актуальной.

Исследование линейчатого спектра вещества позволяет найти, из каких калогенолитических ферментов оно состоит и в каком количестве содержится каждый элемент в данном веществе. Количественное содержание фермента в исследуемом образце определяется методом сравнения интенсивности отдельных линий спектра этого фермента с интенсивностью линий другого калогенолитического фермента, количественное содержание которого в образце понятно. Способ определения качественного и количественного состава вещества по его спектру называется спектральным анализом [1].

Измерение спектра поглощения в амниотической жидкости в зависимости от длины волны проходящего света представляет собой плавную кривую с максимальным поглощением на определённой длине волне. Так, например, при наличии в амниотической жидкости повышенного количества билирубина показатели оптической плотности дают пик поглощения на длине волны 450 нм, причем размер пика пропорционален содержанию пигмента. Как известно повышенное содержание этого пигмента связано с патологическим течением беременности [4].

Аналогичный подход может быть реализован для широкого анализа содержания калогенолитических ферментов в амниотической жидкости.

Используя имеющийся в лаборатории материалов функциональ­ной электроники физического факультета спектрофотометр СФ-2000, проводятся измерения на образцах, предоставленных медцентром Mama Vita для разработки методики оптического анализа и контроля калогенолитических ферментов при беременности и родах.

Спектрофотометр СФ-2000 — это спектрофотометр с диодной матрицей. Конструктивные решения, примененные в СФ-2000, позволили достичь оптимального баланса между быстродействием, компактностью и точностью работы.

Конструкция прибора такова, что УФ- и видимый каналы работают совершенно раздельно, что исключает их взаимное влияние. Все элементы, влияющие на фокусировку, выделение спектрального интервала и детектирование индивидуально оптимизированы для каждого из каналов.

В спектрофотометре используются высококлассные оптические элементы с кварцевым покрытием для получения характеристик пропускания с минимальным светорассеянием. Оптический луч сфокусирован таким образом, что в кюветном отделении свет проходит только через нижнюю часть кюветы, и для измерения достаточно наливать пробу всего лишь на высоту 1 см, т.е. для стандартной кюветы К10 достаточно всего 1 мл пробы. Это особенно важно при использовании спектрофотометра в лабораториях медицинских учреждений.

В качестве источников УФ-излучения используются качественные дейтериевые лампы Hamamatsu (Япония), а в канале видимого света — галогеновые лампы Philips. Таким образом, даже при интенсивной работе необходимость замены источников излучения в связи с выработкой их ресурса возникает нескоро. Операция замены ламп предельно проста за счет быстросъемных держателей.

Детекторами излучения служат ПЗС-линейки с высокими параметрами о чувствительности и разрешения. Совместно с точнейшими технологиями обработки оптических элементов и новыми решениями в оптической схеме это обеспечивает уровень спектрального разрешения, достаточный для лабораторных измерений, в т.ч. в фармацевтической отрасли. Спектральная ширина щели 1 нм позволяет фиксировать практически любой спектр без искажений, связанных с «размытием» оптической плотности в узких спектральных полосах. Измерение некоторых участков спектра на приборах с большей спектральной шириной щели может привести к искажению значений оптической плотности на выбранных длинах волн.

Высокоскоростной интерфейс связи с компьютером (USB) обеспечивает быстрый двунаправленный обмен данными с компьютером, повышая комфортность работы оператора [3].

Для разработки методики оптического экспресс контроля содержания калогенолитических ферментов в амниотической жидкости.

·Необходимо решить следующие задачи:

·Предполагается получить спектры пропускания большого количества проб (не менее 100 пациентов) амниотической жидкости на спектрофотометр CФ-2000.

·Провести анализ и систематизацию оптических спектров на основании литературных данных и лабораторных анализов (биохимических), а так же с учётом диагноза.

·Составить описание методики и рекомендаций по применению оптического экспресс метода анализа амниотической жидкости.

Экспериментальные кривые, полученные на установке СФ-2000 приведены на рис. 1.

Рисунок 1. Зависимость оптической плотности амниотической жидкости от длины волны света: KS1, KS2, KS3, KS4, KS5, KS6, KS7 — образцы амниотической жидкости у пациенток 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.

Как следует из рис. 1, присутствие в жидкости билирубина определяется по пику на длине волны 460 нм. Предложены и используются различные системы для оценки спектрофотограмм — шкала Лили, шкала Фреда и др. Они позволяют определить тяжесть заболевания у плода и выбрать правильную тактику ведения пациентки — консервативный метод, досрочное родоразрешение или внутриутробные трансфузии.

В результате исследования проб KS1, KS2, KS3, KS4, после сравнения с калибровочной кривой, полученной на СФ-2000 (рис. 2) были определены концентрации билирубина (см. табл. 1).

Из литературы [2] известно, что в 34–35 недели пропускание менее 0,1 через амниотическую жидкость свидетельствует об отсутствии заболевания плода. Увеличение пропускания происходит при развитии гемолитической болезни плода: значения 0,1–0,15 указывают на лёгкую степень заболевания, 0,15–0,2 — среднюю; пропускание более 0,2 с большой вероятностью позволяет предположить наличие тяжёлой формы гемолитическая болезнь плода. Более точно и в более ранние сроки беременности (начиная с 24 недели) оценить тяжесть гемолитической болезни плода возможно при исследовании пропускания света в амниотической жидкости при различных длинах волн света с помощью спектрофотометра.

Рисунок 2. Калибровочная кривая билирубина.

Таблица 1.

Полученные значения оптической плотности билирубина интерпретируют согласно шкале Лили, которая делится на зоны: 1, 2А, 2В, 2С, 3 (рис. 3)

Рисунок 3. Шкала Лили.

Если значение оптической плотности билирубина соответствует первой зоне, плод следует считать здоровым или резус-отрицательным. Если значение оптической плотности билирубина соответствует третьей зоне шкалы Лили, то при сроке гестации до 34 нед показано проведение кордоцентеза и внутриутробного переливания крови, после 34-й недели следует провести родоразрешение.

Долгое время метод Лили считали одним из основных для диагностики степени тяжести гемолитической болезни плода. Однако в настоящий момент этот метод представляет исторический интерес, имеет относительное значение, поскольку он неинформативен при апластическом характере анемии у плода, промежуточные его значения (2-я зона) не дают чётких представлений о тяжести заболевания и требуют выполнения повторных инвазивных вмешательств, усиливающих сенсибилизацию.

Чтобы делать заключение о возможных патологиях, необходимо полученные результаты сравнить с другими независимыми методами.

Как видно из выше сказанного, на примере билирубина, спектрофотометрия является быстрым, дешевым методом определения наличия калогенолитических ферментов в амниотической жидкости и дальнейшая разработка метода в отношении широкого спектра ферментов позволит применять этот метод на практике для диагностики протекания беременности.

Список литературы:

1.Антонов В.Ф., Черныш А.М. Практикум по биофизике: учебное пособие для студентов высших учебных заведений. — Москва: Гуманит. изд. центр ВЛАДОС, 2001. — 352с.

2.Долгов В.В., Ованесов Е.В., Щетникович К.А. Фотометрия в лабораторной практике. — Москва: Российская медицинская академия последипломного образования, 2004. — 142с.

3.ОКБ Спектр — Режим доступа: http://www.okb-spectr.ru/index.php?page=sf2000construct

4.Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика. — Москва: Высшая школа, 1996. — 616с.