ИЗМЕНЕНИЯ  ФУНКЦИОНАЛЬНОГО  СОСТОЯНИЯ  КЛЕТОЧНЫХ  СТРУКТУР  У  КРЫС  ПРИ  ВОЗДЕЙСТВИИ  ВЗВЕШЕННЫХ  ПЫЛЕВЫХ  ЧАСТИЦ  (РМ_2,5,  РМ₁₀)

Намазбаева  Зулкия  Игеновна

д-р  мед.  наук,  профессор,  руководитель  лаборатории  экологической  биохимии  и  генетики  Национального  центра  гигиены  труда  и  профессиональных  заболеваний,  Республика  Казахстан,  г.  Караганда

E-mail:  zin9357@mail.ru

Базелюк  Людмила  Тимофеевна

д-р  биол.  наук,  профессор,  главный  научный  сотрудник  лаборатории  экологической  биохимии  и  генетики  Национального  центра  гигиены  труда  и  профессиональных  заболеваний,  Республика  Казахстан,  г.  Караганда

E-mail:  bazeluk42@mail.ru

Агеев  Дмитрий  Владимирович

младший  научный  сотрудник  лаборатории  экологической  биохимии  и  генетики

Национального  центра  гигиены  труда  и  профессиональных  заболеваний,  Республика  Казахстан,  г.  Караганда

E-mail:  ageevdimon88@mail.ru

Сабиров  Жанбол  Байжанович

младший  научный  сотрудник  лаборатории  экологической  биохимии  и  генетики  Национального  центра  гигиены  труда  и  профессиональных  заболеваний,  Республика  Казахстан,  г.  Караганда

E-mail:  audacious  zap@mail.ru

СHANGES  IN  THE  FUNCTIONAL  STATE  OF  THE  CELL  STRUCTURES  IN  RATS  UNDER  THE  INFLUENCE  OF  SUSPENDED  DUST  PARTICLES  (PM_2,5,  PM₁₀  )

Zulkiya  Namazbaeva

MD,  Professor,  Head  of  Laboratory,  “National  Center  of  Hygiene  and  Occupational  Diseases”,  Republic  of  Kazakhstan,  Karaganda

Lyudmila  Bazelyuk

Sc.D.,Professor,  Senior  Researcher  “National  Center  of  Hygiene  and  Occupational  Diseases”,  Republic  of  Kazakhstan,  Karaganda

Dmitriy  Agueyev

research  Associate  “National  Center  of  Hygiene  and  Occupational  Diseases”,  Republic  of  Kazakhstan,  Karaganda

Zhanbol  Sabirov

research  Associate  “National  Center  of  Hygiene  and  Occupational  Diseases”,  Republic  of  Kazakhstan,  Karaganda

АННОТАЦИЯ

Целью  данного  исследования  является  экспериментальное  изучение  токсичности  взвешенных  частиц  (РМ_2,5,  РМ₁₀)_.  В  ходе  30-го  дневного  эксперимента  на  подопытных  животных  (крысах)  были  проведены  биохимические  и  цитологические  исследования.  В  результате  выявлен  общетоксический  эффект  (свободно-радикальное  окисление,  дисбаланс  ПОЛ/АОЗ,  генерация  метаболитов  оксида  азота,  накопление  средних  молекул,  на  клеточном  уровне  —  накопление  нейтрофилов,  снижение  количества  нормальных  макрофагов,  накопление  деструктивных  изменений  в  клетках  внутренних  органов.)

ABSTRACT

The  purpose  of  this  study  is  to  investigate  the  toxicity  of  dust  particles  (РМ_2,5,  РМ₁₀).  During  the  30-day  experiment  in  experimental  animals  (rats)  were  carried  out  biochemical  and  cytological  studies.  He  result  revealed  a  general  toxic  effect  (free-radical  oxidation,  the  imbalance  POL  /  AOS,  the  generation  of  nitric  oxide  metabolites,  the  accumulation  of  middle  molecules,  at  a  cellular  level,  neutrophil  accumulation,  reducing  the  amount  of  normal  macrophages,  the  accumulation  of  destructive  changes  in  the  cells  of  internal  organs).

Ключевые  слова:  ксенобиотики;  токсичность;  клетки  лёгких;  желудка;  печени;  щитовидная  железа;  почки.

Keywords:  хenobiotics;  toxicity;  light,  stomach;  liver  cells;  thyroid;  kidney.

Загрязнение  атмосферного  воздуха  является  одной  из  основных  причин  нарушения  экологического  равновесия  и,  как  следствие,  возникновения  кризисных  экологических  ситуаций  в  промышленных  регионах  и  оказывает  наибольшее  влияние  на  состояние  здоровья  большинства  населения.  По  данным  ВОЗ  [6],  воздействие  атмосферного  воздуха  ежегодно  приводит  к  смерти  от  200  до  570  тыс.  человек  и  на  долю  этого  фактора  приходится  около  0,4—1,1  %  всех  случаев  смерти  в  год.  Определение  концентрации  пыли  различных  фракций  (РМ_2,5,  РМ₁₀)  необходимо  для  получения  фактических  данных  о  качестве  воздуха,  оценки  вреда,  наносимого  здоровью.  Во  многих  странах  мира  накоплены  обширные  эпидемиологические  и  клинические  данные,  свидетельствующие  о  серьёзных  угрозах  здоровью  населения,  обусловленному  загрязнением  атмосферного  воздуха  взвешенными  частицами  (TSP).  В  настоящее  время  атмосферная  пыль  становится  одним  из  приоритетных  загрязнителей  при  организации  мониторинга  окружающей  среды  [3,  с.  41—43,  7,  с.  2—4]. 

Многокомпонентные  и  сложные  по  составу  взвешенные  частицы  (TSP)  способны  в  силу  своего  химического  состава  и  дисперсности  глубоко  проникать  в  организм  и  оказывать  токсическое  воздействие  на  метаболическом,  клеточном,  гормональном  уровнях  [2,  с.  5—9].

Исследование  воздействия  взвешенных  частиц  —  РМ_2,5,  РМ₁₀,  (TSP)  проведено  с  целью  выявления  его  токсичности  в  эксперименте,  как  наиболее  распространенного  загрязнителя  на  урбанизированных  территориях  и  вместе  с  тем,  как  наименее  изученного  в  качестве  поллютанта.

Материалы  и  методы: 

В  эксперименте  использовано  30  особей  нелинейных  крыс,  весом  200—220  гр.,  содержавшихся  в  условиях  вивария.  Опыты  проводились  с  учетом  требований  работы  с  экспериментальными  животными  [4,  c.  17].  Использована  внутрибрюшинная  методика  введения  TSP  в  дозе  25мг/мл  (однократно).  По  истечении  30  дней  проводили  декапитацию  крыс.  Длительность  эксперимента  была  выбрана  с  учетом  способности  TSP  вызывать  метаболические  нарушения,  с  учетом  отдаленных  эффектов.  По  истечению  срока  эксперимента  проводили  цитологические,  биохимические  исследования. 

Содержание  органических  веществ  в  пыли  и  воздухе  определялось  с  помощью  газовой  хроматографии  на  газовом  хроматографе  Agilent  7890A  с  масс-спектрометром  5975  inert  XL  (USA).  Содержание  бенз(а)пирена  определялось  на  высокоэффективном  жидкостном  хроматографе  LC-20  Prominence  фирмы  Shimadzu  (Япония). 

Содержание  тяжелых  металлов  в  пробах  пыли  определялось  с  помощью  атомно-абсорбционного  метода  на  атомно-абсорбционном  спектрометре  с  графитовой  печью  МГА-915. 

Химический  состав  мелкодисперсной  пыли  (мг/мл)  составил:  углеводороды  —  27;  минеральные  масла  —  195;  сажа  —  14,8;  ксилол  —  12,3;  бензол  —  1,2;  толуол  —  2,3;  формальдегид  —  1,02;  фенол  —  0,14;бенз(а)пирен  —  0,00002;  железо  —  2,3;  медь  —  0,03;  цинк  —  0,67;  марганец  —  0,05;  свинец  —  0,02;  хром  —  0,032;  мышьяк  —  0,008;  кадмий  —  0,015;  никель  —  0,027.

Биохимические  исследования  проводились  на  спектрометре  СФ-2000  (Россия).  Анализ  цитоморфологических  характеристик  проводился  на  микроскопе  МС-200  (Австрия,  2004).  Одним  из  объективированных  критериев  безопасности,  согласно  концепции  общей  токсикологии,  нами  были  оценены  цитологические  реакции  со  стороны  следующих  клеточных  структур  —  бронхоальвеолярный  лаваж  (БАЛ),  лёгкие,  желудок,  печень,  щитовидная  железа  и  почки.  Под  слабым  эфирным  наркозом  вскрывали  мышцы  передней  поверхности  шеи,  выделяли  трахею,  вводили  в  её  просвет  стальную  иглу,  которую  фиксировали  лигатурой.  Через  иглу  в  лёгкие  вводили  дробно  5  мл  физиологического  раствора  и  тут  же  отсасывали  перфузат.  Такая  методика  позволила  получить  бронхиальные  смывы,  не  содержащие  примеси  крови.  Центрифугирование  проводили  в  течение  10  минут,  при  2000  оборотов  в  минуту,  надосадочную  жидкость  выливали,  а  из  осадка  делали  мазки  на  БАЛ.  С  лёгких,  желудка,  печени,  щитовидной  железы  и  почек  делали  мазки  —  отпечатки,  которые  высушивали  при  комнатной  температуре.  Мазки  окрашивали  по  Романовскому-Гимза.  При  микроскопировании  с  увеличением  в  1000  раз,  подсчитывали  200  клеток  с  каждого  мазка  [1,  c.  30].

Результаты  обрабатывали  с  использованием  пакета  прикладных  программ  STATISTIСA  5.5  [5,  c.  312].

Условные  сокращения:

РМ  —  от  англ.  particulate  matter  —  твёрдые  примеси  в  атмосфере,  мелкодисперсные  фракции  взвешенных  веществ  (РМ_2,5  —  РМ₁₀)

TSP  —  взвешенные  вещества,  недифференцированная  по  составу  пыль,  аэрозоль  в  атмосферном  воздухе

ПОЛ  —  перекисное  окисление  липидов

АОЗ  —  антиоксидантная  защита

КД  —  диеновые  конъюганты  (первичный  продукт)

ДК  —  диенкетоны  (вторичный  продукт)

NO  —  оксид  азота

БАЛ  —  бронхолёгочный  лаваж

АМ  —  альвеолярные  макрофаги

БКК  —  большие  канальцевые  клетки

МКК  —  малые  канальцевые  клетки

ДМКК  —  дегенерированные  малые  канальцевые  клетки

ДБКК  —  дегенерированные  большие  канальцевые  клетки

ГК  —  главные  клетки

ДГК  —  дегенерированные  главные  клетки

ДАМ  —  дегенерированные  альвеолярные  макрофаги

ДЦК  —  дегенерированные  цилиндрические  клетки

ДНЛ  —  дегенерированные  нейтрофильные  лейкоциты

ДОК  —  дегенерированные  обкладочные  клетки

ДСОК  —  дегенерированные  слизеобразующие  обкладочные  клетки

СОК  —  слизеобразующие  клетки

НЛ  —  нейтрофильные  лейкоциты

ОК  —  обкладочные  клетки

ПН-I  —  пневмоциты  I-  типа

ПН-II  —  дегенерированные  пневмоциты  II-  типа

ДПН-I  —  дегенерированные  пневмоциты  I  -  типа 

ДПН-II  —  дегенерированные  пневмоциты  II-  типа

ТК  —  тёмные  клетки

СК  —  светлые  клетки

ДСК  —  дегенерированные  светлые  клетки. 

Результаты: 

После  30-дневного  введения  мелкодисперсной  пыли  внутрибрюшинно,  биохимическими  методами  выявили  возрастание  первичных  и  конечных  продуктов  ПОЛ  в  бронхолёгочном  лаваже,  в  легких  и  печени. 

Значительное  снижение  ДК  свидетельствует  о  начальной  деструкции  мембран  и  является  неблагоприятным  прогностическим  тестом,  так  как  в  местах  образования  ДК  создаются  ионофорные  участки,  что  приводит  к  увеличению  концентрации  внутриклеточных  ионов  натрия,  в  след  за  которым  следует  вода,  происходит  набухание  клетки,  а  в  последующем  ее  некроз,  либо  некробиоз.  Возрастает  количество  вторичных  продуктов  в  БАЛ,  легких,  печени,  указывающие  на  высокую  степень  окисленности  клеточных  структур  (табл.  1).

Таблица  1. 

Показатели  ПОЛ  при  воздействии  мелкодисперсной  пыли  в  дозе  25  мг/мл

*  p<0,05

**  p<0,01

По-видимому,  воздействие  РМ  вызывает  интоксикацию,  проявляющуюся  снижением  эффективности  окислительного  фосфорилирования.  При  этом,  возможно,  включаются  компенсаторные  механизмы,  активизируется  электронный  транспорт  через  альтернативные  пути,  что  приводит  к  увеличению  концентрации  кислородных  радикалов.  Необходимо  обратить  внимание  на  однонаправленность  изменений  вторичных  продуктов.

Вторичные  продукты  ПОЛ-триенкетоны  способны  мигрировать  за  счет  двойных  связей  полиненасыщенных  жирных  кислот,  образуя  высоко  реактивные  дитриены.  Одним  из  показателей,  свидетельствующих  об  эндогенной  интоксикации,  является  накопление  метаболитов  NO  и  средних  молекул  в  биохимических  жидкостях  (табл.  2).

Таблица  2. 

Метаболиты  NO  и  содержание  средних  молекул  при  воздействии  пыли  в  дозе  25  мг/мл

Согласно  цитоморфологическим  исследованиям,  выявлено  нарушение,  проявляющееся  повышением  в  БАЛ  количества  ДАМ  на  89  %,  ДЦК  в  2,5  раза,  по  сравнению  с  контрольной  группой  (табл.  3).  Со  стороны  лёгких  отмечено  повышение  количества  клеток  ДАМ  в  4  раза,  снижение  количества  ПН-I  в  4,5  раза,  повышение  количества  ДПН-I  в  2,9  раз  и  ДПН-II  типа  в  6  раз.  У  50  %  животных  в  макрофагах  и  ПН-I  и  ПН-II  типа  обнаружена  мутагенная  активность  (центральная  ядерная  перетяжка,  двуядерные  клетки)  и  в  среднем  составило  (1,8+0,44  %),  что  на  38  %  выше  контрольных  величин.  Количество  клеток  с  микробной  обсеменённостью  (стрептококки  и  стафилококки)  повышено  в  2,2  раза  (табл.  4).  Со  стороны  клеток  желудка  отмечено  снижение  количества  главных  клеток  в  3,5  раза,  обкладочных  клеток  в  3  раза,  повышение  количества  ДОК  в  2,1  раза  и  ДСОК  в  8,8  раз  и  повышение  количества  микрофлоры  в  7,5  раз,  по  сравнению  с  контрольной  группой  животных  (табл.  5).  Со  стороны  печени  нами  обнаружено  повышение  количества  ДСК  гепатоцитов  в  3,5  раза,  в  основном,  встречались  гепатоциты  с  вакуольной  дистрофией  (табл.  6).  Со  стороны  щитовидной  железы  обнаружено  снижение  количества  гранулированных  В-клеток  в  2,3  раза  и  повышение  количества  дегранулированных  В-клеток  в  6,6  раз  (табл.  7).  Со  стороны  почек  обнаружено  снижение  количества  БКК  на  45%  и  МКК  в  2  раза,  повышение  количества  ДБКК  в  2,8  раза  и  двуядерных  клеток,  по  сравнению  с  контрольной  группой  в  32,1  раза  (табл.  8). 

Подводя  итог  наших  исследований,  можно  сделать  следующие  выводы:

1.  В  экспериментальных  исследованиях,  при  воздействии  взвешенных  частиц  урбанизированных  территорий,  в  состав  которой  входят  соединения  металлов  и  стойкие  органические  вещества,  установлен  токсический  эффект,  где  общим  метаболическим  синдромом  явилось:  свободно-радикальное  окисление,  дисбаланс  ПОЛ/АОЗ,  генерация  метаболитов  оксида  азота,  накопление  средних  молекул.

2.  На  клеточном  уровне  в  бронхиальных  смывах  у  крыс  выявлен  цитоток-  сический  эффект  пыли,  проявляющийся  повышением  количества  дегенерированных  альвеолярных  макрофагов  и  дегенерированных  цилиндрических  эпителиальных  клеток,  повышением  количества  микрофлоры,  что  приводит  к  снижению  числа  жизнеспособных  клеток  бронхоальвеолярного  лаважа. 

3.  Со  стороны  лёгких  обнаружено  повышение  количества  дегенерированных  альвеолярных  макрофагов,  снижение  количества  пневмоцитов  I  типа  и  пневмоцитов  II  типа,  и  повышение  количества  ДПН-I  типа  и  ДПН-II  типа,  что  может  приводить  к  нарушению  газообмена  в  лёгких. 

4.  Со  стороны  желудка  при  действии  пыли  обнаружено  снижение  количества  полноценных  главных,  обкладочных  и  повышение  количества  дегенерированных  этих  же  клеток,  что  приводит  к  нарушению  секреторной  и  всасывающей  функции  желудочных  желёз.

5.  В  клетках  печени  мы  обнаружили  повышенное  количество  дегенерированных  светлых  гепатоцитов  с  вакуольной  дистрофией,  что  приводит  к  нарушению  детоксикационной  функции  печени.

6.  Со  стороны  щитовидной  железы  отмечено  снижение  активных  В-клеток,  которые  секретируют  трийодтиронин  (Т₃)  и  отмечено  резкое  повышение  дегранулированных  В-клеток. 

7.  В  почках  наблюдается  снижение  количества  нормальных  больших  и  малых  канальцевых  клеток  и  повышение  дегенерированных  больших  канальцевых  клеток,  резко  повышено  количество  двуядерных  клеток,  что  приводит  к  снижению  клубочковой  и  фильтрационной  функции  почек.