ОСАЖДЕНИЕ  БЕЛКОВ  И  ПЕПТИДОВ  РАСТВОРОМ  СУЛЬФАТА  АММОНИЯ

Василенко  Дмитрий  Викторович

канд.  мед.  наук,  доцент,  ВГМА  им.  Н.Н.  Бурденко,  г.  Воронеж,  зав.  лабораторией  ООО  «Медицинский  центр  «ДиАл-Мед»,  г.  Воронеж

E-mail: 

Маслов  Алексей  Иванович

младший  научный  сотрудник,  ВГМА  им.  Н.Н.  Бурденко,  г.  Воронеж

генеральный  директор  ООО  Медицинский  центр  «ДиАл-Мед»,  г.  Воронеж

E-mail: 

Адуев  Махач  Сулайманович

студент  5  курса  педиатрического  факультета  ВГМА  им.  Н.Н.  Бурденко  г.  Воронеж

Оников  Михаил  Михайлович

студент  6  курса  педиатрического  факультета  ВГМА  им.  Н.Н.  Бурденко  г.  Воронеж

PRECIPITATION  OF  PROTEINS  AND  PEPTIDES  WITH  SOLUTION  OF  AMMONIUM  SULFATE

Vasilenko  Dmitry

candidate  of  Medical  Science,  Associate  Professor  of  Voronezh  State  Medical  Academy  of  N.N.  Burdenko,  Head  of  the  Laboratory  of  medical  center  ”DiAl-Med”,  Voronezh

Maslov  Alexey

junior  researcher  of  Voronezh  State  Medical  Academy  of  N.N.  Burdenko,  Voronezh

general  manager  of  medical  center  ”DiAl-Med”,  Voronezh

Aduev  Makhach

5th  year  student  of  pediatric  faculty  of  Voronezh  State  Medical  Academy  of  N.N.  Burdenko,  Voronezh

Onikov  Michail

6th  year  student  of  pediatric  faculty  of  Voronezh  State  Medical  Academy  of  N.N.  Burdenko,  Voronezh

АННОТАЦИЯ

Анализируется  влияние  раствора  сульфата  аммония  на  осаждение  белков  и  пептидов  средней  молекулярной  массы.  Концентрация  исследуемых  веществ  определялась  с  помощью  иммунохемилюминесцентного  анализа  на  анализаторе  Immulite.  Выявлено  существенное  снижение  концентрации  белков  в  плазме  крови  после  осаждения  насыщенным  раствором  сульфата  аммония.  Концентрация  пептидов  снижается  в  значительно  меньшей  степени  и  зависит  от  аминокислотного  состава.  Выявлена  большая  устойчивость  протеогликанов  к  осаждению  по  сравнению  с  белками.

ABSTRACT

The  influence  of  the  solution  of  ammonium  sulfate  precipitation  of  proteins  and  medium-weight  peptides  are  analysed.  The  concentration  of  the  substances  was  determined  using  the  immunochemiluminescent  analysis  on  the  analyzer  Immulite.  A  significant  reduction  of  the  concentration  of  protein  in  the  blood  plasma  after  the  precipitation  of  a  saturated  solution  of  ammonium  sulfate  was  revealed.  The  concentration  of  peptides  is  reduced  to  a  much  lesser  degree  and  depends  on  amino  acid  composition.  The  most  resistant  proteoglycans  to  be  precipitated  in  comparison  with  the  protein  was  identified.

Ключевые  слова:  среднемолекулярные  пептиды;  эндогенная  интоксикация;  сульфат  аммония.

Keywords:  middle-molecules  peptides;  endogenous  intoxication;  ammonium  sulfate. 

Многие  хронические  заболевания  сопровождаются  накоплением  в  тканях  и  биологических  жидкостях  эндотоксинов.  Развивается  синдром  эндогенной  интоксикации  (ЭИ)  [1,  с.  69],  приводящий  к  снижению  эффективности  фармакотерапии  и  другим  осложнениям.  Среди  эндотоксинов  наиболее  существенную  группу  составляют  вещества  пептидной  природы  с  молекулярной  массой  от  одной  до  5  тысяч  Дальтон  (кДа)  [4,  с.  99],  которые  получили  название  среднемолекулярных  пептидов  (СМП).  В  ряде  источников  указывается  на  то,  что  уровень  в  плазме  данных  соединений  коррелирует  с  тяжестью  протекания  заболевания  [2,  с.  144,  3,  с.  59].  В  связи  с  небольшими  размерами  пептиды  не  могут  формировать  третичную  структуру.  Вследствие  этого  радикалы  ароматических  аминокислот  остаются  незамаскированными.  Эта  особенность  повышает  адгезивные  свойства  средних  молекул.

Для  диагностики  ЭИ  используется  количественное  определение  СМП  в  плазме  крови,  которое  проводится  путем  гель-хроматографии  пептидов  на  сефадексах.  Проведение  хроматографического  исследования  пептидов  в  нативной  плазме  затруднено  в  связи  с  необходимостью  отделения  их  от  высокомолекулярных  белков,  концентрация  которых  в  50-70  раз  выше.  Поэтому  в  лабораторной  практике  используется  предварительное  осаждение  высокомолекулярных  белков  раствором  сульфата  аммония  [5,  с.  190].  Однако  осаждающая  способность  сульфата  аммония  в  отношении  СМП  остается  неизученной.

Цель  исследования  —  определить  концентрацию  белков  и  СМП  в  супернатантах  после  осаждения  белков  раствором  сульфата  аммония.

Задачи  исследования. 

1.  Оценить  влияние  сульфата  аммония  на  проведение  иммунохемилюминесцентных  реакций.

2.  Определить  величину  осаждения  белков  и  пептидов  полунасыщенным  и  насыщенным  раствором  сульфата  аммония.

Методы  исследования.  Осаждение  белков  и  пептидов  проводили  с  помощью  сульфата  аммония.  В  первой  серии  исследований  смешивали  равные  объемы  растворов  белков  и  пептидов  с  равным  объемом  насыщенного  раствора  сульфата  аммония.  Получался  полунасыщенный  раствор  сульфата  аммония.  Во  второй  серии  исследований  к  раствору  белков  добавляли  порошок  сульфата  аммония  до  прекращения  растворения.  Получался  насыщенный  раствор  сульфата  аммония.  После  центрифугирования  в  супернатанте  определяли  концентрации  исследуемых  веществ.

В  работе  использовались  контрольные  растворы  индивидуальных  белков  и  пептидов  производства  фирмы  Diagnostics  Product  Corporation,  ныне  подразделение  фирмы  Siemens. 

Количественное  определение  индивидуальных  белков  и  пептидов  проводилось  на  иммунохемилюминесцентном  анализаторе  Immulite  производства  Siemens.  Супернатант  из  полунасыщенного  раствора  сульфата  аммония  непосредственно  вносился  в  пробирку  для  образцов  анализатора.  Супернатант  из  насыщенного  раствора  предварительно  разводился  в  два  раза  бидистиллированной  водой.  Иммунный  анализ  проводился  анализатором  автоматически  согласно  программе,  заданной  фирмой-производителем.

Результаты  исследования.  Первоначально  было  проведено  изучение  влияния  насыщенного  раствора  сульфата  аммония  на  проведение  иммунохемилюминесцентного  анализа.  Для  этого  перед  исследованием  содержания  альбумина  в  контрольном  образце  непосредственно  в  реакционную  пробирку  анализатора  добавлен  насыщенный  раствор  сульфата  аммония  в  количестве  50  мкл.  Затем  анализатор  внес  в  автоматическом  режиме  в  эту  же  пробирку  50  мкл  контрольного  раствора  альбумина  без  сульфата  аммония.  Концентрация  альбумина  в  контрольном  растворе  составила  23,1  мкг/мл,  а  в  образце  с  предварительным  добавлением  равного  объема  насыщенного  сульфата  аммония  12,9  мкг/мл.  Результаты  после  пересчета  на  разведение  существенно  не  различаются,  что  свидетельствует  об  отсутствии  влияния  сульфата  аммония  на  протекание  иммунной  реакции  в  реакционной  пробирке.

В  следующей  серии  исследований  изучались  изменения  концентрации  индивидуальных  белков  и  пептидов  после  осаждения  крупномолекулярных  веществ  раствором  сульфата  аммония.

Для  изучения  осаждения  белков  были  изучены  изменения  концентрации  альфа-фетопротеина  (молекулярная  масса  70  кДа),  альбумина  (молекулярная  масса  66  кДа)  и  тиреотропного  гормона  (молекулярная  масса  28  кДа),  а  также  гликопротеин  СА-19-9  (молекулярная  масса  1000  кДа),  большая  часть  молекулы  которого  представлена  углеводными  компонентами.

Установлены  следующие  изменения  концентрации  веществ  в  процессе  осаждения  белков  сульфатом  аммония.  Концентрация  АФП  в  контрольном  растворе  составила  32±1,3  МЕ/мл,  в  полунасыщенном  растворе  сульфата  аммония  33±1,7  МЕ/мл,  в  насыщенном  растворе  менее  0,2  МЕ/мл.  Из  полученных  результатов  видно,  что  альфа-фетопротеин  не  осаждается  в  полунасыщенном  сульфате  аммония,  но  практически  полностью  осаждается  в  насыщенном  растворе.

Осаждение  альбумина  отличалось  от  осаждения  АФП.  В  контрольном  растворе  содержалось  23,1  мкг/мл  альбумина,  в  полунасыщенном  растворе  17,6±1,3  мкг/мл  и  в  насыщенном  растворе  менее  2,5  мкг/мл.  Следовательно,  в  полунасыщенном  растворе  отмечается  незначительное  снижение  содержания  альбумина.

При  осаждении  крупномолекулярного  гликопротеина  СА-19-9  установлено,  что  в  контрольном  растворе  концентрация  составила  53  Е/мл,  в  полунасыщенном  растворе  сульфата  аммония  36,6±3,1  Е/мл  и  в  насыщенном  растворе  10,9±2,7  Е/мл.  Несмотря  на  высокую  молекулярную  массу,  полного  осаждения  белка  не  произошло.  Конечная  концентрация  СА-19-9  в  насыщенном  растворе  сульфата  аммония  составила  20,5  %  от  исходной.

Небольшой  по  молекулярной  массе  белок  ТТГ  в  процессе  добавления  сульфата  аммония  дает  существенное  снижение  концентрации.  Так,  в  контрольном  растворе  уровень  ТТГ  составил  20,1  мкМЕ/мл,  в  полунасыщенном  1,44±0,2  мкМЕ/мл,  и  в  насыщенном  0,312±0,03  мкМЕ/мл.

Из  представленных  результатов  видно,  что  осаждение  белков  зависит  от  аминокислотного  состава  и  наличия  небелковых  компонентов.

В  группе  индивидуальных  пептидов  использовались  паратгормон  (молекулярная  масса  9500  Да)  и  инсулин  (молекулярная  масса  5700  Да).  Концентрация  паратгормона  в  контрольном  растворе  составила  421  пг/мл,  в  полунасыщенном  и  насыщенном  растворе  соответственно  36,8±3,5  и  23,6±3,4  пг/мл.  Концентрация  инсулина  в  контрольном  растворе  составила  30  мкМЕ/мл,  а  в  насыщенном  растворе  18,9  мкМЕ/мл.  Следовательно,  концентрация  некоторых  индивидуальных  пептидов  в  полунасыщенном  и  насыщенном  растворах  сульфата  аммония  после  осаждения  крупномолекулярных  белков  снижается,  что  может  оказывать  влияние  на  результаты  определения  СМП  при  диагностике  эндотоксикоза.

Выводы. 

1.  Сульфат  аммония  существенно  не  влияет  на  проведение  иммунохемилюминесцентной  реакции  на  анализаторах  серии  Immulite.

2.  Осаждение  индивидуальных  белков  и  пептидов  в  растворах  сульфата  аммония  зависит  от  молекулярной  массы  и  химического  состава  соответствующих  молекул.

Список  литературы:

1.Воронцова  Н.Л.  Эндогенная  интоксикация  у  больных  ИБС  до  и  после  коронарного  шунтирования  //  Эфферентная  терапия.  —  2011.  —  Т.  17.  —  №  4.  —  С.  68—74.

2.Келина  Н.Ю.  Биохимические  проявления  эндотоксикоза:  методические  аспекты  изучения  и  оценки,  прогностическая  значимость  (аналитический  обзор)  /  Н.Ю.  Келина,  Н.В.  Безручко,  Г.К.  Рубцов  //  Вестник  Тюменского  государственного  университета.  —  2012.  —  №  6.  —  С.  143—147.

3.Корякина  Е.В.  Клинико-лабораторная  оценка  синдрома  эндогенной  интоксикации  у  больных  ревматоидным  артритом  /  Е.В.  Корякина,  С.В.  Белова  //  Терапевтический  архив.  —  2006.  —  Т.  78.  —  №  11.  —  С.  59—63.

4.Логинов  В.Н.  Спектр  молекул  средней  массы  как  показатель  эндогенной  интоксикации  у  больных  шизофренией  в  процессе  фармакотерапии  /  В.Н.  Логинов  //  Сибирский  вестник  психиатрии  и  наркологии.  —  2009.  —  №  3.  —  С.  98—100.

5.Цветикова  Л.Н.  Лабораторная  оценка  хронического  эндотоксикоза  у  больных  с  пневмонией  и  хронической  обструктивной  болезнью  легких.  //  Современная  медицина:  Актуальные  вопросы.  —  2013.  —  №  23.  —  С.  187—192.