СТРЕССИНДУЦИРОВАННЫЕ  ИЗМЕНЕНИЯ  ФУНКЦИОНАЛЬНОГО  СОСТОЯНИЯ  КАРДИОМИОЦИТОВ  КРЫС

Игрунова  Ксения  Николаевна

д-р  мед.  наук,  НМАПО  имени  П.Л.  Шупика,  руководитель  ЦНИЛ,  Украина  г.  Киев

Зозуля  Иван  Савович

д-р  мед.  наук,  НМАПО  имени  П.Л.  Шупика,  проректор  по  научной  работе,  Украина  г.  Киев

Ватлицов  Денис  Владимирович

канд.  биол.  наук,  НМАПО  имени  П.Л.  Шупика,  ст.н.с.  ЦНИЛ,  Украина  г.  Киев

Русецкая  Наталия  Витальевна

канд.  биол.  наук,  НМАПО  имени  П.Л.  Шупика,  н.с.,  Украина  г.  Киев

Андрияш  Виктория  Васильевна

НМАПО  имени  П.Л  Шупика,  инженер1  кат.,  Украина  г.  Киев

Терещук  Анна  Владимировна

студент  кафедры  промышленной  биотехнологии  факультета  биотехнологии  и  биотехники,  НТУУ  «КПИ»,  Украина  г.  Киев

E-mail:  cndl@yandex.ru

STRESS-INDUCED  CHANGES  IN  THE  FUNCTIONAL  STATE  OF  RAT  CARDIOMYOCYTES

Igrunova  Ksenia  Nikolaevna

dSc,  NMAPE  named  after  P.L.  Shupyk,  Head  of  CSRL,  Ukraine  Kiev

Zozulja  Ivan  Savovich

dSc,  NMAPE  named  after  P.L.  Shupyk,  Vice-Rector  for  research,  Ukraine  Kiev

Vatlitsov  Denys  Vladimirovich

phD,  NMAPE  named  after  P.L.  Shupyk,  senior  researcher  of  CSRL,  Ukraine  Kiev

Rusetskaya  Nataliya  Vital’evna

phD,  NMAPE  named  after  P.L.  Shupyk,  researcher,  Ukraine  Kiev

Andiyash  Victoriya  Victorovna

NMAPE  named  after  P.L.  Shupyk,  I  cat.  engineer,  Ukraine  Kiev

Tereschuk  Anna  Vladimirovna

NTU  of  Ukraine  «KPI»,  student  of  industrial  biotechnology  department  of  faculty  of  biotechnology  and  biotechnics,  Ukraine  Kiev

АННОТАЦИЯ

В  настоящее  время  установлено  важное  значение  стресса  и  апоптоза  в  регуляции  работы  ССС.  Целью  работы  являлось  моделирование  сердечной  патологии,  а  также  изучение  влияния  стресса  на  развитие  патологичных  состояний.  Исследования  клеточной  регуляции  проводилось  на  проточном  цитометре.  В  статье  показано  влияние  разных  типов  стресса  на  развитие  патологии  сердечной  мышцы  у  экспериментальных  животных,  с  помощью  определения  количества  апоптических  клеток.  Выявлено,  что  степень  накопления  необратимых  изменений  в  кардиомиоцитах  зависит  от  вида  стресса.

ABSTRACT

It  has  established  the  important  role  of  stress  and  apoptosis  in  regulation  of  the  cardiovascular  system  for  present  days.  The  aim  of  the  study  was  to  model  of  heart  disease,  as  well  as  studying  the  effects  of  stress  on  the  development  of  pathology.  Study  of  cellular  regulation  was  performed  on  the  flow  cytometer.  The  paper  shows  the  effect  of  different  types  of  stress  on  the  development  of  pathology  of  rat  cardiomyocyte,  by  determining  the  number  of  dead  cells.  It  was  shown  that  the  extent  of  permanent  changes  in  cardiomyocytes  depends  of  the  type  of  stress.

Ключевые  слова:  кардиомиоциты;  стресс;  апоптоз;  некроз;  пролиферация.

Keywords:  cardiomyocyte;  stress;  apoptosis;  necrosis;  proliferation.

Введение.  Заболевания  сердечно-сосудистой  системы  занимают  первое  место  в  мире  среди  других  болезней  по  распространенности  и  смертности.  Внезапность  развития  летальных  проявлений  таких  заболеваний  обусловлена  длительным  накоплением  повреждений  в  органах  и  тканях  за  счет  апоптической  (клинически  не  проявляемой)  гибели  клеток  органа  до  уровня  критического  снижения  его  функциональных  возможностей,  что  характерно  для  действия  факторов  стресса.

В  настоящее  время  установлено  важное  значение  апоптоза,  который  играет  решающую  роль  в  эффективности  деятельности  сердечно  сосудистой  системы,  а  стрессорная  нагрузка  приводит  к  дифференцированному  изменению  уровня  апоптоза  различных  клеток  организма.  Апоптоз,  привлек  к  себе  внимание  кардиологов,  как  потенциальный  патогенетический  фактор  при  различных  сердечно-сосудистых  заболеваниях,  поскольку,  среди  всех  известных  механизмов  развития  болезней  сердца,  этот  вариант  смерти  кардиомиоцитов  (КМЦ)  является  наиболее  высокорегулируемым  при  разработке  методов  терапевтического  воздействия  [2,  с.  610].

Большое  количество  исследований  показывают,  что  стресс  разной  этиологии  и  продолжительности  (острый  или  хронический)  может  иметь  дифференцированное  влияние  на  функционирование  организма  и  если  кратковременный  острый  стресс  стимулирует,  то  хронический  стресс  отрицательно  сказывается  практически  на  всех  системах  организма.  Было  показано,  что  иммунные  показатели  в  результате  стрессорного  влияния  изменяются  опосредованно  через  гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую  систему,  а  также  вегетативную  (симпатическую  и  парасимпатическую)  нервную  систему  [3,  с.  95]. 

Таким  образом,  вопрос  изучения  взаимосвязи  между  стрессорной  нагрузкой  и  развитием  патологий  сердечно-сосудистой  системы  весьма  актуален  на  сегодняшний  день.

Цель.  Смоделировать  развитие  сердечной  патологии  на  экспериментальных  животных,  а  также  изучить  влияние  разных  типов  стресса  как  фактора  развитие  патологичных  состояний  сердечной  мышцы  экспериментальных  животных  (крыс).

Материалы  и  методы.  Исследование  функционального  состояние  клеток  миокарда  проводилось  на  белых  беспородных  самцах  крыс  (n=60)  весом  200—250  г.  Животные  содержались  на  стандартном  рационе  вивария.  Все  процедуры  проводились  соответственно  международным  правилам  гуманного  отношения  к  животным. 

За  основу  психо-эмоционального  напряжения  было  выбрана  сенсорно  контактная  модель  изучения  агресивности  и  исследования  влияния  психо-эмоционального  стресорного  напряжения  крыс,  как  фактора  развития  патологичных  состояний  міокарда  [4,  с.  287]

Перед  началом  стрессирования  у  всех  экспериментальных  животных  были  проведены  лабораторные  исследования  крови.

Экспериментальных  животных  ежедневно  высаживали  попарно  в  темные  биксы,  каждый  день  сменяя  им  партнеров,  которые  были  иммобилизованы.  Дополнительно  крыс,  которые  находились  в  пеналах  погружали  в  воду  t  +5  ^oC,  постепенно  увеличивая  время  пребывания,  после  чего  их  же  погружали  в  воду  t  42  ^oC  с  целью  формирования  экстремальной  нагрузки  на  серце  с  помощью  психо-эмоционального  напряжения  и  физического  истощения  (1  группа).  Животные  группы  2,  ежедневно  подвергались  только  психо-эмоциональным  нагрузкам.  Третья  группа  животных  подвергалась  только  иммобилизационной  и  температурной  нагрузке  без  психо-эмоционального  комонента.  Последняя  группа  животных  (группа  4),  являлась  контрольной  и  не  подвергалась  действию  стрессорных  факторов.  Стрессорная  нагрузка  увеличивалась  постепенно  на  протяжении  всего  исследования  длительностью  112  суток.

Состояние  кардиомиоцитов  оценивали  по  показателям  апоптоза,  некроза  и  изменений  митохондриального  мембранного  потенциала.  Для  определения  уровня  апоптоза  анексиновим  методом  и  изучения  мембранного  потенциала  митохондрий,  готовили  суспензию  кардиомиоцитов  в  буферном  растворе  на  механическом  ресуспендизаторе  BD  Medimachine  (Becton  Dickinson,  США)  с  использованием  набора  для  определения  апоптоза  Annexin  V-FITC  Apoptosis  detection  Kit  I  (BD  Bioscience  Pharmingen,  США).

Изменения  митохондального  мембранного  потенциала  клеточной  суспензии  оценивали,  используя  методику  с  флуорохромами  родамином  123  (“Fluka”)  и  пропидий  йодидом  (“Sigma”)  [54,  с.  240—242].  Предложенный  метод  позволяет  определить  в  исследуемом  образце:  жизнеспособные  клетки,  некротические  и  апоптические  клетки.

Клеточный  цикл,  а,  следовательно,  и  пролиферативную  активность  оценивали  путем  определения  клеточного  цикла  суспензии  кардиомицитов  с  использованием  флуоресцентного  зонда  пропидий  йодид  (“Sigma”)  [5,  с.  89—90;  1,  с.  33].

Исследование  уровня  апоптоза  анексиновим  методом,  изменений  митохондриального  мембранного  потенциала  и  клеточного  цикла  проводили  на  проточном  цитометре  PAS  (  Partec,  Германия  ).

Статистическую  обработку  проводили  с  использованием  программы  Statistica,  применяли  t-критерий  Стьюдента  и  описательную  статистику.  Доверительные  интервалы  средних  значений  определяли  путем  подсчета  стандартной  ошибки.  Различия  считали  статистически  значимыми  при  р  <0,05.

Результаты 

Было  выявлено,  что  кардиомиоциты  подопытных  крыс  характеризуются  низкой  пролиферативной  активностью  не  зависимо  от  типа  стрессового  напряжения.  Но  все  же,  было  зафиксировано  незначительное  статистически  достоверное  (р<0,05)  снижение  пролиферации  кардиомиоцитов  у  животных  второй  группы,  в  сравнении  с  животными  других  групп.  Увеличение  количества  клеток,  которые  находились  в  G1  фазе  до  61,59±2,61  %,  у  животных  второй  группы  и  дало  возможность  сделать  заключение,  что  психо-эмоциональная  нагрузка  снижала  пролиферативную  активность  клеток,  что  в  дальнейшем  может  приводить  к  сердечной  недостаточности,  поскольку  репарационные  возможности  органа  снижаются  (Рис.  1).

Рисунок  1.  Распределение  кардиомиоцитов  крыс  по  стадиям  клеточного  цикла  под  влиянием  разных  типов  стресорной  нагрузки

Изучение  распределения  клеток  по  типу  клеточной  гибели,  при  действии  экспериментальной  стресорной  нагрузки  проводилось  в  два  этапа:  по  мембранным  маркерам  (раняя  и  поздняя  стадии  апоптоза)  и  по  изменениям  митохондриального  потенциала  (апоптоз  и  некроз),  внутриклеточный  запуск  гибели  клетки. 

Изучение  транслокации  фосфатидилсерина  и  изменение  проницаемости  цитоплазматической  мембраны  выявило  статистически  значимое  (р<0,05)  снижение  сумарного  апоптоза  кардиомиоцитов  с  84,87±4,84  %  в  контрольной  группе  (группа  4)  до  52,59±8,98  %  в  1  группе  животных  (рис.  2.).  При  этом  в  других  экспериментальных  групах  наблюдалось,  статистически  не  достоверное  снижение  количества  кардиомиоцитов  с  признаками  апоптоза.

Рисунок  2.  Изменения  уровня  сумарного  апоптоза  КМЦ  экспериментальных  животных  по  результатам  исследования  мембранных  маркеров  под  влиянием  разных  типов  стресорной  нагрузки

Исследование  ранней  и  поздней  стадии  апоптоза,  показало  статистически  значимое  (р<0,05)  снижение  уровня  апоптических  клеток  на  ранней  стадии  в  1  группе  (28,51±3,84  %)  в  сравнении  с  контрольными  показателями  73,21±11,15  %,  в  других  группах  статистически  достоверных  изменений  выявлено  не  было  (рис.  3.).

Исследование  поздней  энергозависимой  стадии  спонтанного  апоптоза  выявило  статистически  достоверное  (р<0,05)  увеличение  данного  показателя  в  первой  (24,08±9,51  %)  и  снижение  до  6,7±2,12  %  во  второй  группе  в  сравнении  с  контрольными  значениями  11,67±6,76  %  (рис.  4.  ).

Рисунок  3.  Изменения  уровня  КМЦ  на  ранней  стадии  апоптоза  экспериментальных  животных  по  результатам  исследования  мембранных  маркеров  под  влиянием  разных  типов  стрессорного  напряжения

Рисунок  4.  Изменение  количества  КМЦ  на  поздней  стадии  апоптоза  экспериментальных  животных  по  результатам  исследования  мембранных  маркеров  под  влиянием  разных  типов  стрессорного  напряжения

Похожая  тенденция,  в  изменении  уровня  апоптических  клеток,  наблюдалась  и  при  изучении  изменений  митохондриального  мембранного  потенциала  КМЦ.  В  первой  группе  значение  соответствовало  23,42±1,92  %,  во  второй  15,58±2,76  %,  в  третей  18,04±1,00  %,  а  в  четвертой  15,76±1,60  %  (рис.  5.).

Рисунок  5.  Изменения  уровня  апоптоза  КМЦ  по  результатам  исследования  изменений  митохондриального  мембранного  потенциала  экспериментальных  животных  под  влиянием  разных  типов  стрессорной  нагрузки

Исследование  изменений  количества  некротических  КМЦ  в  зависимости  от  типа  стрессорного  напряжения  показало  значительное  статистически  достоверное  (р<0.05)  увеличение  таких  клеток  в  основной  группе  до  4,89±2,02  %  в  сравнении  с  контрольной  0,68±0,17  %.  В  других  группах  уровень  некроза  оставался  на  уровне  контрольного  значения  (рис.  6.).

Рисунок  6.  Изменение  уровня  некроза  КМЦ  экспериментальных  животных  под  влиянием  разных  типов  стрессорной  нагрузки

Таким  образом,  было  показано,  что  длительная  иммобилизация  в  сочетании  с  гипо-  и  гипертермическим  шоком  на  фоне  психо-эмоциональной  стрессорной  нагрузки  приводит  к  накоплению  необратимых  изменений  в  кардиомиоцитах  экспериментальных  животных  о  чем  свидетельствует  увеличение  количества  кардиомиоцитов,  идентифицируемых  на  поздней  стадии  апоптоза  и  некроза.  Поздняя  стадия  апоптоза  является  необратимой,  поэтому  увеличение  клеток  именно  на  этой  стадии  указывает  на  массовую  гибель  КМЦ.  Также  было  выявлено  почти  десятикратное  увеличение  количества  некротических  клеток  в  образцах  тканей  сердца  крыс  первой  группы,  что  указывает  на  рост  риска  развития  дисфункции  органа  и  как  следствие  —  смерти.  Поскольку  увеличение  некротического  поражения  вызывает  увеличение  нагрузки  на  весь  организм,  а  в  органе  развиваются  воспалительные  процессы  с  лавинно  подобным  увеличением  очага  поражения. 

Выше  изложенный  материал  указывает  на  значимую  роль  психо-эмоционального  и  иммобилизационного  стресса  на  рост  рисков  развития  патологий  сердца,  что  отражалось  в  росте  количества  поврежденных  кардиомиоцитов.  А  поскольку  современная  жизнь  несет  в  себе  большое  количество  психо-эмоциональных  стрессорных  факторов  и,  в  большинстве  случаев,  современный  человек  ведет  гиподинамический  и  гипокинетический  образ  жизни,  что  и  приводит  к  росту  заболеваний  ССС,  увеличению  внезапной  сердечной  смерти  в  современной  цивилизации.

Список  литературы:

1.Королева  О.С.  Биомаркеры  в  кардиологии:  регистрация  внутрисосудистого  воспаления/  О.С.  Королева,  Д.А.  Затейщиков//  Фарматека.  —  2007.  —  №  8.  —  C.  30—36.

2.Don’t  lose  heart-therapeutic  value  of  apoptosis  prevention  in  the  treatment  of  cardiovascular  disease  /  J.L.V.  Reeve,  A.M.  Duffy,  T.O’Brien,  A.  Samali  //  J.  Cell.  Mol.  Med.  —  2005.  —  Vol.  9.  —  P.  609—622.

3.Hussain  D.  Stress  immunity  and  health:  research  findings  and  implications/  D.  Hussain  //  International  Journal  of  Psychosocial  Rehabilitation.  —  2011  —  Vol.  15,  —  №  1.  —  P.  94—100.

4.Kudryavtseva  N.N.  A  sensory  contact  model  for  the  study  of  aggressive  and  submissive  behavior  in  male  mice  /  N.N.  Kudryavtseva  //  Aggressive  behavior  —  Vol.  17.  —  1991.  —  P.  285—291.

5.Flow  cytometry:  a  practical  approach  3rd  edition  /University  of  Oxford  ;  edited  by  Michael  G.  Ormerod.  Oxford:  Oxford  Univ.  Press,  2000.  —  276  p.