ПОИСК ПРОДУЦЕНТОВ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ – СУБСТРАТА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОСТАГЛАНДИНОВ

Утегенова Гульжахан Абдужалиловна

магистрант, КазНУ им. аль-Фараби, г. Алматы, Республика Казахстан

Бейсембаева Роза Ултубаевна

профессор, д-р. биол. наук, КазНУ им. аль-Фараби, г. Алматы, Республика Казастан

Оразова Салтанат Болатовна

канд. биол. наук, КазНУ им. аль-Фараби,г.  Алматы, Республика Казахстан

Цуркан Яна Сергеевна

PhD-докторант, КазНУ им. аль-Фараби, г. Алматы, Республика Казахстан

Калбаева Алия Моминовна

PhD-докторант, КазНУ им. аль-Фараби, г. Алматы, Республика Казахстан

Карпенюк Татьяна Анатольевна

д-р. биол. наук, профессор, КазНУ им. аль-Фараби, г. Алматы, Республика Казахстан

Гончарова Алла Владимировна

канд. биол. наук, доцент, КазНУ им. аль-Фараби, г. Алматы, Республика Казахстан

E-mail:  

Простагландины являются регуляторами многих физиологических процессов организма. Они широко применяются в медицинской и ветеринарной практике. Биосинтез простагландинов осуществляется по унифицированной схеме в основном из арахидоновой  кислоты, которая  под действием биферментной простагландинсинтазной системы превращается в  PGЕ₂. Кроме того, сама арахидоновая кислота проявляет широкий спектр  физиологической активности, например, участвует в регуляции уровня внутриклеточного кальция, модуляции кальциевых ответов клеток на тромбин  и аденозинтрифосфорную кислоту.

Основной проблемой  биотехнологии получения простагландинов является высокая лабильность ферментов простагландинсинтазной системы, ответственной за их синтез в организме, а также отсутствие продуцентов арахидоновой кислоты, которые способны вырабатывать её в большом количестве.

Нами создан гетерогенный биокатализатор на основе простагландинсинтазной биферментной системы со стабильными и активными PGH-синтазой и PGH-конвертазой [3, 4]. Настоящее исследование направлено на поиск эффективного продуцента арахидоновой кислоты, на основе которого будет разработан метод  ее получения.

Известно, что ацетилсалициловая кислота (АСК) является необратимым ингибитором метаболизма арахидоновой кислоты, он ацетилирует Ser-530 простагландин Н синтазы и тормозит синтез простагландинов [6]. В настоящее время  неспособность бактерий, грибов и дрожжей расти в присутствии АСК применяют в качестве критерия для отбора штаммов, синтезирующих метаболиты арахидоновой кислоты [5].

Объектами для скрининга служили штаммы одноклеточных микроводорослей, выделенных из водоемов Казахстана. Определение АСК  - чувствительности  микроводорослей проводили по методу Ерошина В.К. и др. [2]. Метод основан на корреляции между уровнем синтеза арахидоновой кислоты и чувствительностью роста микроорганизмов к низким концентрациям ацетилсалициловой кислоты. Штаммы микроводорослей:  Scenedesmus quadricauda,  Chlorella sp. (T₄),  Chlorella sp. (Ч₃),  Chlorella sp. (E₂₄),  Oocystis rhomboidea, культивировали на 1,4% агаре, штаммы Scenedesmus quadricauda,  Chlorella sp. (T₄),  Chlorella sp. (Ч₃),  Chlorella sp. (E₂₄),  Oocystis rhomboidea – на среде Фитцджеральда, штамм Spirulina platensis (532) – на среде 16. В чашки Петри заливали  среду,  после застывания  делали  в ней 5 лунок. В лунки заливали суспензию микроводорослей с разной концентрацией АСК.  В первую лунку - суспензию микроводорослей  с 1,4 мг АСК, во вторую -  с 1,0 мг АСК, в третью – с 0,84 мг АСК, в четвертую -  с 0,5 мг АСК, в пятую лунку - суспензию микроводорослей без АСК. Чашки Петри оставляли в световых шкафах при температуре 28⁰  на  7-10 суток. Затем измеряли  диаметры (см) зоны ингибирования роста.

Для получения микроводорослей в количестве достаточном для проведения ферментативных исследований их выращивали в жидком варианте соответствующих сред.

Пероксидазную активность PGH-синтазы измеряли спектрофотометрическим методом и выражали в виде количества окисленной формы гваякола (тетрагваякола) [4].

Из полученных результатов следует, что штаммы микроводорослей различаются по своей чувствительности к АСК (таблица 1). Наибольшее ингибирование роста отмечается для штамма Scenedesmus quadricauda и Chlorella sp. (Ч₃).  В то же время при всех концентрациях АСК не наблюдается ингибирование роста штамма Spirulina platensis (532).

Таблица 1. Влияние АСК на рост микроводорослей

Для установления природы чувствительности микроводорослей к АСК нами была определена пероксидазная активность мембранной фракции  аспирин чувствительных штаммов микроводорослей Scenedesmus quadricauda, Chlorella sp(Ч₃), и аспирин нечувствительного штамма Spirulina platensis (532).

Для получения мембранной фракции клетки микроводорослей разрушали методом замораживания/оттаивания клеточной суспензии в жидком азоте, с последующей промывкой фракции мембран, отделенной центрифугированием от супернатанта. Пероксидазная активность мембранной фракции штамма Scenedesmus quadricauda равна 1,375±0,08, Chlorella sp.(Ч₃) -1,18±0,07, Spirulina platensis (532) – 0,61±0,04. Полученные значения могут быть обусловлены  как пероксидазной активностью  PGH-синтазы, так и активностью клеточных пероксидаз.  Поэтому нами был проведено исследование влияния специфического ингибитора PGH-синтазы - аспирина на пероксидазную активность мембранной фракции (рисунок).

Рисунок 1. Влияние аспирина - ингибитора PGH-синтазы на пероксидазную активность мембранной фракции штамма S.quadricauda, штамма Chlorella sp.(Ч₃), Spirulina platensis (532).

Полученные результаты показывают, что пероксидазная активность мембранной фракции Scenedesmus quadricaudа полностью ингибируется при добавлении 30 ммоль АСК, ингибирование активности мембранной фракции Chlorella sp. (Ч₃) при той же концентрации АСК не полное, в случае  Spirulina platensis (532) АСК при всех концентрациях не оказывает никакого влияния. Полученные результаты позволяют предположить, что пероксидазная активность штамма Scenedesmus quadricauda – принадлежит PGH-синтазе, штамма Chlorella sp. (Ч₃) - PGH-синтазе и  пероксидазам , Spirulina platensis (532) – только пероксидазам.

Таким образом, в клетках микроводорослей Scenedesmus quadricauda и  Chlorella sp.(Ч₃) функционирует PGH-синтаза, одним из субстратов которой  является арахидоновая кислота. Следовательно штаммы Scenedesmus quadricauda и  Chlorella sp.(Ч₃) могут быть природными источниками арахидоновой кислоты.

Штаммы  Scenedesmus quadricauda и  Chlorella sp.(Ч₃) были отобраны нами в качестве перспективных для дальнейшего изучения в связи с вопросами  разработки технологии получения арахидоновой кислоты.

Список литературы:

1.Абрамченко В.В., Новиков Е.И.  Использование простагландинов в    акушерстве // Акушерство и гинекология. - 1982. - N. 9. - С. 16-18.

2.Бейсембаева Р.У., Бедарева Т.Е., Зацерковная Т.А., Дунгенова Р.Е. Исследование простагландинсинтазной системы мононуклеарных клеток периферической крови овец. 1. Выделение простагландинсинтазной системы и изучение свойств простагландин-Н-синтазы // Вестник КазНУ. Сер. биол. - 2003. -  № 3 (21). - С. 21-25.

3.Бейсембаева Р.У., Карпенюк Т.А., Гончарова А.В.  Оценка эффективности использования простагландин-синтазной системы овец для создания биотехнологии получения простагландинов // Материалы VI Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 1. – М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ Д.И. Менделеева, 2011. - С. 213-214.

4.Бейсембаева Р.У., Карпенюк Т.А., Гончарова А.В. Бедарева Т.Е. Иммобилизация мембраносвязанной  простагландинсинтазной биферментной системы клеток крови овец // Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2011. - № 2 (48). - С. 100-103.

5.Давлетбаев И.М. Биосинтез полиненасыщенных жирных кислот и их производных: Автореф. дис. к. б.н. – УФА, 2002. – 24 с.

6.Зацерковная Т.А. Исследование in vitro регуляции адреналином и ионами кальция активности простагландин-Н-синтазы везикулярных желез барана: Дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04. - Алматы: КазНУ, 2001. – 82 c.