ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЕЛЕЗЕНКИ ПРИ ЧУМЕ СОБАК

HISTOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF SPLEEN IN CANINE DISTEMPER

Nurbek Aldaiarov

candidate of Vet. Sciences, Assistant Professor,

Kyrgyz-Turkish Manas University,

Kyrgyzstan, Bishkek

Lyudmila Lykhina

candidate of Vet. Sciences, Acting Assistant Professor, Kyrgyz National Agrarian University named after K.I. Scriabin,

Kyrgyzstan, Bishkek

АННОТАЦИЯ

С применением гистологических и иммуногистохимических методов исследования проанализировано морфофункциональное состояние селезенки в норме и при чуме у собак. При патологии отмечены очаговые некротизированные участки в белой пульпе органа, и они окружены с AK10H3 позитивными или зараженными клетками. В белой пульпе органа количество Т- и В-лимфоцитов незначительно, а их пролиферативная активность низкая. Функционирующие лимфоидные фолликулы не обнаруживались. Вирусосодержащие клетки диффузно распространены и в красной пульпе.

ABSTRACT

Applying histological and immunohistochemical methods of study were analyzed morphofunctional state of normal spleen and in canine distemper. In pathology, there revealed focal necrotizing areas in white pulp and they surrounded with AK10H3 positive cells. In white pulp of spleen quantity of T-and B-lymphocytes are not significant, and their proliferative activity were low. Functionally active lymphoid follicles weren’t determined. Virus inclusion cells were diffusely located in red pulp of organ.

Ключевые слова: селезенка; морфофункциональное состояние; маркеры иммуногистохимии; чума собак.

Keywords: spleen; morphofunctional state; immunohistochemistry markers; canine distemper.

Введение. Исследования патологии различного генеза с точки зрения функциональной иммуноморфологии является одним из современных направлений изучения болезней животных. Суть данного направления заключается в установлении участия и роли органов и тканей иммуногенеза при развитии патологии разной этиологии.

Чума плотоядных – характеризуется лихорадкой, катаральным воспалением слизистых оболочек, пневмонией, расстройством нервной системы, желудочно-кишечного тракта, мочевыделительной системы и других систем организма, т. е. болезнь является мультисистемной. Заболевание распространено во всех странах мира.

В данный момент доступны многие виды вакцин против этой болезни. Однако спорадические случаи заражения чумой собак иногда имеют место даже среди вакцинированной популяции [4, с. 527]. Научные работы, посвященные исследованию чумы плотоядных в странах СНГ, носят фрагментарный характер, а в нашей республике исследования такого рода не проводились. В доступной русскоязычной литературе встречаются только отдельные труды по выработке вакцин против чумы плотоядных [1; 2; 3].

Значительное количество научных трудов посвящены фундаментальному исследованию патологии чумы плотоядных при ее различных формах [5; 6; 7; 8].

Однако эти исследования не комплексны и не сочетаются с иммунологическими ответными реакциями организма, что и послужило причиной изучения данной научной проблемы.

Цель данной статьи – сравнение нормального морфофункционального состояния Т- и В-зон с их морфофункциональным состоянием при заражении ВЧП.

Объекты и методы исследования. Данная работа выполнялась в КНАУ им. К.И. Скрябина (Кыргызская Республика), Институте ветеринарной патологии высшей ветеринарной школы города Ганновера (ФРГ, 2004) и в Институте ветеринарной патологии Цюрихского университета (Швейцария, 2007–2008).

Тканевые пробы от селезенки были получены от 58 собак, больных чумой, в течение 2004–2007 года в г. Бишкеке и зафиксированы в 10 %-ном водном растворе нейтрального формалина. Обезвоживание кусочков производилось в специальной машине в вакууме.

Серийные срезы готовились на полуавтоматическом микротоме новой модификаций толщиной 2–4 мкм. Для общего обзора гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Восстановление антигена для иммуногистохимии производили с помощью автоклава Паскаль (20 минут, +98⁰ С и 2 минуты при +125⁰ С под давлением) при использовании антиген восстанавливающих буферных растворов PH 9.0 (EDTA или основной буферный раствор PH 9.0) и цитратный буфер (PH 6.0) в соответствии с инструкцией производителя. Был использован SABC (Streptavidin and Biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular Complex) метод иммуногистохимии.

Для выявления Т-лимфоцитов использовали антитело Polyclonal Rabbit Anti-Human T cell, CD 3; для выявления В-лимфоцитов – антитело Monoclonal Mouse Anti-Human B cell, CD 79ά cy; для выявления макрофагов – антитело Monoclonal Mouse Anti-Human Myeloid/Histocyte Antigen, Clon MAC 387; для выявления пролиферацию клеток – антитело Monoclonal Mouse Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA); для выявления ВЧП использовали антитело – mono AK 10H3.

Окрашивание производили вручную в специальной влажной камере. Срезы дополнительно окрашивали гематоксилином Майера. При положительной реакции клетки были окрашены в красный или коричневый цвета.

Результаты исследования. Как известно, в белой пульпе селезенки у клинически здоровых собак отмечаются две структурно отличающиеся зоны лимфоидной ткани. Первая – лимфоидная ткань шарообразной структуры (лимфоидные фолликулы, или В-зоны) и вторая – присоединенные к ним муфты (в виде диффузной лимфоидной ткани Т-зоны), окружающие центральные артерии, или артериолы.

Лимфоидные фолликулы образованы в основном В-лимфоцитами и соответственно это зона называется В-зоной. По данным иммуногистохимических исследований, эта зона в основном заселена В-лимфоцитами, имеется также незначительное количество Т-лимфоцитов и единичные макрофаги. Лимфоидные фолликулы имеют разные формы и структуры. Так, лимфоидные фолликулы с четко выраженным герминативным центром окружены тонким ободком плотно расположенных клеток – мантийной зоной, и периферической (диффузно заселенными лимфоцитами и макрофагами) – маргинальной зоной – они называются вторичными лимфоидными фолликулами. В морфофункциональном отношении они оцениваются как активно функционирующиеся структуры гуморального иммунитета. Пролиферативная активность клеток, особенно в герминативном центре, высокая. Отмечаются отдельные фигуры апоптоза. Также встречаются лимфоидные фолликулы с плотным скоплением диффузных лимфоцитов без выраженных зон. Они называются первичными или в функциональном отношении находятся в состоянии покоя. Лимфоидные фолликулы с рыхло расположенными клетками, с множественными фигурами апоптоза (отмечаются в основном в герминативном центре) – в функциональном отношении являются фолликулами, истратившими свои ресурсы. Селезеночные макрофаги заселены более компактно, окружают белую пульпу и располагаются диффузно по всей красной пульпе.

Т-клетки, или эффекторы клеточного иммунитета, расположены около В-зоны. В Т-зоне клетки заселены диффузно и беспорядочно по сравнению с В-зоной. Иммуногистохимия указывает, что в этой зоне заселены в основном Т-лимфоциты и незначительное количество макрофагов.

В красной пульпе имеются диффузно заселенные клетки лимфоидной ткани (Т- и В-лимфоциты) и значительное количество селезеночных макрофагов.

При патологии микроскопически в белой пульпе селезенки четко выделяются некротизированные участки разной формы и величины (рис. 1А, Б). Эти участки окружены макрофагами, и отдельные макрофаги находятся среди некротизированной массы. Отмечается увеличение количества макрофагов. ВЧП позитивные клетки встречаются по всей пульпе диффузно, и более компактное заселение зараженных клеток заметно в В-зоне лимфоцитов (среди и вокруг некротизированной массы) (рис. 1В). Не наблюдаются активно функционирующие и первичные лимфоидные фолликулы. Отмечается сильное сокращение количества В-лимфоцитов и нарушение структуры лимфоидных фолликулов (рис. 1Г). Наряду с клетками, подвергнутыми некрозу, отмечаются фигуры апоптоза и мелкие апоптосомы (рис. 2Б). Т-зона клеток также подвержена сильной атрофии, и CD3 позитивные клетки наблюдаются по всей пульпе селезенки диффузно (рис. 2Д).

Рисунок 1. Парафиновые срезы селезенки собаки, зараженной ВЧП

Глубокие структурные нарушения белой пульпы селезенки: А – некроз В-зоны и истощение Т-зоны белой пульпы. Гем. и эозин. х62,5; Б – некротизированный участок и рыхло заселенные клетки белой пульпы. Гем. и эозин. х250; В – ВЧП позитивные клетки. AK 10H3. х62,5; Г – некроз и истощение В-зоны белой пульпы и CD79 позитивные клетки. CD79αсу. х125; Д – диффузное заселение Т-клеток в пульпе органа. CD3. x125.

В заключение мы полагаем, что сильное истощение Т- и В-зоны лимфоидной ткани селезенки при заражении ВЧП указывает на полное уничтожение защитных клеток организма и доказывает иммуносупрессорную природу ВЧП.

Список литературы:

1. Домский И.А. Иммунизация пушных зверей ассоциированной вакциной против сальмонеллеза, чумы и парвовирусных инфекций плотоядных // Док. РАСХН. – М., 2002. 2. – С. 51–53.
2. Рябцев Г.С., Степанов А.В. Применение миксоферона при чуме плотоядных у собак // Мат-лы всерос. научно-практической конф-ции: Ветеринария, современные аспекты и перспективы. – Орел, 2002. – С. 30–34.
3. Сазонкин В.Н., Уласов В.И., Домский И.А. Оценка антигенности и иммуногенности вакцин против чумы собак // Реф. журнал Ветеринария. – М., 2006. 6. – С. 30.
4. Distribution of inclusion bodies in tissue from 100 dogs infected with canine distemper virus / T. Kubo, Y. Kagawa, H. Taniyama, A. Hasegawa // Vet. Med. Sc., 2007. 69 (5). – P. 527–529.
5. Gröne A., Doherr M.G., Zurbriggen A. Canine distemper virus infection of canine footpad epidermis // Vet. Dermatology. 2004. 15. – P. 159–167.
6. Rudd P.A., Cattaneo R., von Messling V. Canine distemper virus uses both the anterograde and the hematogenous pathway for neuroinvasion // Virology. 2006. 80. – Р. 9361–9370.
7. Vimentin-positive astrocytes in canine distemper—a target for canine distemper virus especially in chronic lesions? / F. Seehusen, E. Orlando, K. Wewetzer, W. Baumgärtner // Acta Neuropathol. 2007. 114. – P. 597–608.
8. Wünschmann A., Kremmer E., Baumgärtner W. Phonotypical characterization of T and B cell areas in lymphoid tissue of dogs with spontaneous distemper // Vet. Immunology and Immunopathology. 2000. 73. – P. 83–98.