РАЗРАБОТКА  И  ИССЛЕДОВАНИЯ  ЭКОЛОГИЧЕСКОГО  КОМБИКОРМА  И  ЕГО  ВЛИЯНИЕ  НА  ОКИСЛИТЕЛЬНУЮ  ДЕСТРУКЦИЮ  БИОПОЛИМЕРОВ,  НА  ПРИМЕРЕ  ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ  МОДИФИКАЦИИ  БЕЛКОВ  ПЛАЗМЫ  КРОВИ  КРОЛИКА  (ORYCTOLAGUS  CUNICULUS)

Тарасов  Сергей  Сергеевич

аспирант  ННГУ  им.  Н.И.  Лобачевского,  г.  Нижний  Новгород

E-mail: 

Экологический  комбикорм  –  является  новым  продуктом  разработанный  нами  в  результате  проведённых  исследований.  Основной  целью  данного  комбикорма  является  комплексное  решение  проблемы  полнорационного  питания  животных,  без  причинения  им  вреда,  а  следовательно  получения  экологически  безопасной  продукции  животноводства  [2,10,13].

Было  выявлено,  что  данную  проблему  можно  решить  применением,  метода  биологической  инокуляции  микофлорой  [5,8]  зернового  компонента  комбикормов,  а  так  же  с  использованием  метода  глубокой  криоэкстракции  [9,20],  что  вполне  применимо  в  промышленных  масштабах.  При  этом  появляется  возможность  вариабельного  подбора  комбикорма  для  узкой  группы  животных,  адаптации  его  путём  подбора  необходимых  компонентов  в  тех  концентрациях,  которые  необходимы  для  той  или  иной  группы  животных.  Таким  образом  экокомбикорм  включает  в  себя  две  основные  инновационные  составляющие:

·     Применение  метода  инокуляции  зернового  субстрата  путём  добавления  в  стерильный,  прозрачный  бункер,  зернового  компонента  и  мицелия  гриба,  выращенного  на  агарозной  твёрдой  питательной  среде.

·     Применение  метода  криоэкстракции  дополнительных  компонентов,  с  целью  выделения  в  легкодоступную  форму  витаминов,  антиоксидантов  и  иных  добавок,  необходимых  для  оптимального  роста  животного.

Описание  способа  получения  экологического  комбикорма  в  лабораторных  условиях

Подбор  компонентов  проводили  путём  сопоставления  потребности  животного  в  питательных  веществах  и  их  содержания  в  определённых  составляющих  комбикорма  с  учётом  потерь  20%  и  профицитом  10  %,  таким  образом,  готовый  продукт  потенциально  содержал  130%  всех  необходимых  питательных  веществ.

Комбикорма  разрабатывали  из  расчёта  100  г.  на  ½  суточной  потребности  в  питательных  веществах  кролика,  таким  образом,  для  полного  удовлетворения  одного  взрослого  животного  необходимо  200  г  экокомбикорма.

Для  приготовления  продукта  использовали  классическую  рецептуру  приготовления  комбикорма  кроликов  [10].  Компонент,  приготовленный  по  классическому  рецепту,  составлял  48%  экокомбикорма.  Остальная  часть  52%  мицелизированный  зерновой  субстрат  и  растительно-минеральный  экстракт  в  соотношениях  48%  и  4%  соответственно.  Мицелий  получали  из  вегетативного  тела  гриба  [8,12],  выращивали  его  на  скошенных  средах  [5],  далее  получали  первою  маточную  культуру  [5],  после  чего  выращивали  вторую  промежуточную  культуру  на  зерновом  субстрате  [5],  что  являлось  вторым  компонентом  экокомбикорма.  Полученный  мицелий  измельчали  и  смешивали  с  остальными  компонентами  экокомбикорма.

Экстракт  готовили  в  фарфоровой  ступке,  путём  добавления  в  измельчённый  растительный  субстрат  двойного  буфера  [9,11,14,20]  бикарбонатный  и  ацетатный  буфера  и  жидкого  азота,  после  чего  растирали  фарфоровым  пестиком  до  образования  гомогената.

Все  эти  компоненты  смешивали,  добавляли  минеральные  вещества  [20]  и  гранулировали,  в  результате  чего  получили  образец  экокомбикорма,  который  использовали  в  дальнейших  исследованиях  описанных  ниже.

Описание  возможности  производства  экологического  комбикорма  в  промышленных  масштабах.

Краткое  описание  оборудования

Стандартное  оборудование  включает  в  себя:  дробилку  зерна,  смеситель,  измельчитель,  гранулятор,  охладитель,  подробно  описывается  во  многих  литературных  источниках  [15-19,21,23]

Специфическое  оборудование:  генератор  мицелия,  инокуляционный  бункер,  варильный  котёл,  автоклав,  криогомогенатор.

Краткое  описание  специфического  оборудования

Генератор  мицелия  представляет  собой  прибор,  в  котором  находятся  модифицированные  чашки  петри  сложенные  в  компактные  стопки.  Прибор  постоянно  поддерживает  необходимую  температуру  и  влажность.  Генератор  мицелия  находится  в  стерильном  боксе,  где  биотехнолог  проводит  посев  мицелия  на  агарозную  среду  в  модифицированные  чашки  петри  из  маточной  культуры  гриба  выращенной  на  скошенных  средах  в  пробирках  [5].  После  освоения  культурой  субстрата,  агарозная  среда  вместе  с  мицелием  автоматически  нарезается  на  мелкие  части  и  по  инокуляционному  проводу  поступает  в  инокуляционный  бункер  (рис.1)

Инокуляционный  бункер  –  прозрачный,  стерильный  цилиндр,  который  содержит  в  своём  составе  перемешивающий  вентиль  и  выдавливающий  аппарат  для  перемещения  освоенного  субстрата  в  смеситель.

Варильный  котёл  -  прибор,  состоящий  из  большой  металлической  чаши,  в  которую  встроены  нагревательные  элементы,  металлическое  сито  и  мешалка.  Зерно  поступает  в  котёл  с  водой,  и  вариться  определённый  промежуток  времени,  после  чего  вода  сливается,  а  в  проваренное  зерно  добавляются  минеральные  вещества  (мел  и  гипс)  и  перемешиваются.  Общая  смесь  дальше  поступает  в  автоклав.

Автоклав  –  аналогичный  стандартный  автоклав,  отличается  лишь  наличием  выводящего  аппарата,  необходимого  для  перемещения  субстрата  в  инокуляционный  бункер.

Криогомогенатор  представляет  собой  не  металлический  комбайн,  состоящий  из  жерновой  части  (работает  по  типу  лабораторной  ступки  и  пестика)  и  миксера,  куда  из  измельчителя  поступают  растительные  компоненты,  а  так  же  буфер  и  жидкий  азот.

Краткое  описание  производственной  линии

Для  производства  экологического  комбикорма  необходимо  4  компонента:  дроблёная  зерно  смесь,  инокуляционная  зерно  смесь  (заменяет  белковую  добавку),  растительный  крио  экстракт  (заменяет  витаминный  премикс)  и  минеральные  вещества.  Из  них  2  будут  применяться  впервые  в  комбикормовой  промышленности  это  инокуляционная  зерно  смесь  и  криоэкстракт.

На  рисунке  1  изображена  общая  схема  расположения  оборудования,  этапы  производства  экокомбикорма  и  движение  его  компонентов.

Зерно  поступает  в  варильный  котёл  (2),  после  его  готовности  вода  сливается,  а  в  зерно  добавляют  минеральные  вещества  (смесь  мела  и  гипса),  необходимые  для  оптимального  роста  мицелия.

Далее  смесь  перемещается  в  автоклав  (3)  для  стерилизации,  после  чего  по  зернопроводу  (4)  поступает  в  инокуляционный  бункер  (5),  параллельно  в  бункер  поступает  первая  промежуточная  культура  гриба.  Данные  компоненты  поступают  поочерёдно  в  виде  порций,  т.к.  для  оптимального  освоения  зернового  субстрата  первая  промежуточная  культура  должна  быть  распределена  равномерно.  Все  операции  проходят  в  стерильном  помещении  (6).  После  чего  бункер  передвигается  в  термостатное  помещение  (7)  для  освоения  первой  промежуточной  культурой  гриба  субстрата.  Далее  бункер  с  готовым  мицелием  подходит  к  дробилки  (8),  компоненты  из  бункера  переходят  в  дробилку  и  измельчаются.  После  измельчения  компоненты  переходят  в  смеситель  (9)  куда  поступает  так  же  дроблёное  зерно,  крио  экстракт  и  минеральные  добавки.  Все  компоненты  перемешиваются  и  перемещаются  в  гранулятор  (10).  Готовые  гранулы  фиксируются  путём  охлаждения  (11).

Приготовление  первой  промежуточной  культуры  гриба  проводят  в  стерильном  боксе  (12),  для  этого  нужно  использовать  модифицированные  чашки  петри,  в  которые  разливается  питательная  среда,  а  после  остывания  производится  посев  маточной  культуры.  Засаженные  чашки  петри  перемещаются  в  генератор  мицелия  (13),  далее  освоенный  субстрат  переходит  в  инокуляционный  бункер  (5).

Крио  экстракт  готовится  в  криогомогенаторе  (14).  Растительные  компоненты  измельчают  (15),  помещают  в  криогомогенатор  куда  добавляют  буфер  и  жидкий  азот,  после  чего  полученный  гомогенат  переходит  в  смеситель  (9).

Рисунок  1.  Схема  расположения  оборудования  при  производстве  экокомбикорма

Таблица  1. 

Сравнительная  характеристика  оборудования  и  производственной  линии  при  производстве  стандартного  комбикорма  и  экокомбикорма

Влияние  экологического  комбикорма  на  уровень  окислительной  модификации  белков  (ОМБ)  плазмы  крови  кролика  по  сравнению  со  стандартными  комбикормами.

Исследования  проводили  на  кроликах  породы  «Советская  шиншилла»  в  возрасте  от  3  до  5  месяцев  [10].  Животных  выращивали  на  кролиководческой  ферме  «RabbitStar»  ООО  «Вита  Аструм»  в  стандартных  условиях.  Опытные  особи  выделяли  из  общего  стада  кроликов  и  в  течение  2-х  недель  устанавливали  им  определённый  тип  питания.  Всего  в  эксперименте  было  сформировано  2  группы  по  7  животных  в  каждой.  Все  особи  питались  до  начала  эксперимента  стандартными  гранулированными  комбикормами.  Одну  группу  продолжали  кормить  стандартными  комбикормами,  другую,  начали  кормить  экокомбикормом  полученным  в  лабораторных  условиях,  в  течение  2-х  недель.  После  начала  эксперимента,  а  именно  через  1,  3,  7  и  14  суток  проводили  забор  крови  из  ушной  вены  и  исследовали  её. 

Рисунок  2.  Изменение  уровня  ОМБ  плазмы  крови  кролика  при  изменении  рациона  питания  со  стандартного  комбикорма  на  экокомбикорм.

Определение  карбонильных  производных  в  плазме  крови  кролика  проводили  по  модифицированной  методике  Дубининой  [4].  Общий  белок  определяли  биуретовым  методом  (метод  Кингслея  –  Вексельбаума)  [6].  Статистическую  обработку  полученных  результатов  производили  с  помощью  программы  Microsoft  Excel  2003  и  Биостатистика  вер.  4.03  методами  параметрической  статистики,  включающей  –  определение  средней  арифметической  (М)  и  стандартного  отклонения  [3].

В  плазме  крови  кролика  были  выявлены  продукты  окисления  белков,  которые  прореагировали  с  2,4  –  денитрофенилгидразином.  (2,4  –  ДНФГ)  Основное  количество  образовавшихся  динитрофенилгидразонов  относится  к  альдегидо  и  кетонпроизводным  нейтрального  характера.  Существенной  разницы  в  их  содержании  не  выявлено.  Альдегидо  и  кетонпроизводные  основного  характера  в  исследуемых  образцах  были  ниже,  в  1,5  раза,  чем  те  же  производные  нейтрального  характера.  Существенной  разницы  в  их  содержании  так  же  нет,  однако  содержание  альдегидпроизводных  основного  характера  во  всех  образцах  было  ниже,  чем  содержание  кетонпроизводных  того  же  характера.  Содержание  карбонильных  группировок  во  всех  образцах  существенно  ниже,  чем  содержание  всех  остальных  фракций.

На  рисунке  2  видно,  что  после  перехода  на  кормление  животных  экокомбикормом  содержание  продуктов  окислительной  модификации  белков  снижается.  При  этом  можно  выделить  2  пика  снижения  краткосрочный  в  течение  первых  трёх  суток,  когда  происходит  не  значительное  уменьшение  всех  фракций  образовавшихся  в  результате  ОМБ  и  долгосрочный,  зафиксированный  спустя  7-ми  суток  с  момента  изменения  рациона,  наблюдается  существенное  снижение  концентрации  фракций  образовавшихся  в  результате  ОМБ.  Такая  картина  возможно  связана  с  тем,  что  вещества  содержащиеся  в  экокомбикорме  взаимодействуют  с  АФК  и  препятствуют  процессу  новообразования  окисленных  форм  белка,  но  не  могут  восстановить  уже  имеющуюся  окисленную  форму,  поэтому  результаты  в  первые  три  дня  не  сильно  отличаются  от  контроля.  Снижение  уровня  окисленного  белка  в  плазме  крови  кролика  связана  с  действием  протеаз,  которые  постепенно  разрушают  его,  а  антиоксиданты  препятствуют  деструкции  «здоровой»  белковой  молекулы.

Отсутствие  такого  эффекта  в  результате  применения  стандартных  комбикормов,  возможно,  объясняется  тем,  что  они  не  содержать  «естественных»  биологически  активных  веществ,  которые  препятствуют  взаимодействию  активных  форм  кислорода  (АФК)  с  молекулами  белка.  А  искусственные  компоненты  направлены  лишь  на  увеличение  биомассы  и  в  меньшей  степени  защищают  организм  от  атаки  АФК.  Снижение  уровня  окисленного  белка,  может  так  же,  связан  с  наличием  легкодоступного,  полноценного  грибного  белка  в  составе  экокомбикорма,  который  быстро  компенсирует  восстановление  белка  в  крови  после  его  окисления.

Выводы:

1.  Получен  экологический  комбикорм  в  лабораторных  условия.

2.  Сформирована  идея  разработки  оборудования  необходимого  для  производства  экологического  комбикорма  в  промышленных  условиях.

3.  Сформирована  идея  разработки  производственной  линии  состоящий  из  классического  и  специального  комбикормового  оборудования.

4.  Установлено  снижение  уровня  окислительной  модификации  белков  плазмы  крови  кролика  при  применении  экологического  комбикорма  по  сравнению  с  стандартными  кормами.

Список  литературы:

1.Берёзов  Т.Т.,  Коровкин  Б.Ф.,  Биологическая  химия.  –  М.:  Медицина,  1998.,  с.

2.Боярский  Л.Г.  Производство  и  использование  кормов  –  М.:  Росагропромиздат,  1988

3.Гланц  С.  Медико-биологическая  статистика  М.:,  Практика  1999.,  459  с.

4.Дубинина  Е.Е.,  Бурмистров  С.О.,  Ходов  Д.А.,  Поротов  И.Г.  //  Биохимия  –  1995  с.  24-26

5.Дудка  И.А.,  Бисько  Н.А.,  Билай  В.П.  Культивирование  съедобных  грибов  //  Киев:,  Урожай,  1992.-  192  с.

6.Мельников  В.В.  Лабораторные  методы  исследования  в  клинике.  М.:  Медицина,  1987.,  367  с.

7.Мельников  В.В.  Лабораторные  методы  исследования  в  клинике.  М.:  Медицина,  1987.,  367  с.

8.Морозов  А.И.  Грибы:  руководство  п  разведению  //  Донецк:  Сталкер,  2000.,  -  304  с.

9.Практикум  по  биохимии  растений  под  ред.  Полевого  В.В.,  Щипарёва  С.М.,  СПб:,  издательство  Санкт  Петербургского  университета,  1996.,  200с

10.Седов  Ю.Д.  Кролики  разведение,  содержание,  уход,  Ростов  на  Дону,  с  Феникс  2009  173  с.

11.Страйлер  Л.  Биохимия:  в  3-х  т.:  пер  с  англ.  –  М.:  Мир.,  1985

12.Сычёв  П.А.  Экофизиология  высших  грибов  //  Донецк,  Кассиопея,  2000.  –  276  с.

13.Томмэ  М.Ф.  Кормовые  рационы  и  нормы  кормления  для  сельскохозяйственных  животных  .  –  М.:  Сельхозиздат,  1963

14.Уайт  А.,  Хендлер  Ф.,  Смит  Э.,  Леман  И.,  Основы  биохимии:  в  3-х  т.:  пер.  с  англ.  –  М.:  Мир,  1981.,  с

15.Группа  компаний  «Агромолтехника».  [электронный  ресурс]  –  Режим  доступа.  -  URL:  http://agro.su/about.html 

16.Комбикормовые  заводы  серии  «ДОЗА».  [электронный  ресурс]  –  Режим  доступа.  -  URL:  http://dozaagro.ru/research/ 

17.Международная  торговая  компания  ТаоПласт.  [электронный  ресурс]  –  Режим  доступа.  -  URL:  http://taoplast.ru/index.php 

18.Инженерный  центр  «Грант».  [электронный  ресурс]  –  Режим  доступа.  -  URL:  http://www.agrogrant.ru/prod/kombikorm_album.pdf 

19.Богдановичский  комбикормовый  завод.  [электронный  ресурс]  –  Режим  доступа.  -  URL:  http://www.combikorm.ru/ 

20.       Компания  «КриоЛаб».[электронный  ресурс]  –  Режим  доступа.  -  URL:  http://www.cryolaboratory.ru 

21.       НПП  «Экспро».  [электронный  ресурс]  –  Режим  доступа.  -  URL:  http://www.eks-bio.ru/prod2/index.html 

22.       Приготовление  комбикормов  //  Сельма.  [электронный  ресурс]  –  Режим  доступа.  -  URL:  http://www.Selma.ru/84 

23.       Завод  пищевого  оборудования  Прогресс.  [электронный  ресурс]  –  Режим  доступа.  -  URL:  http://www.zavprogress.ru/006_texnol_kombik_01.html