ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕНОЛОКИСЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ МИКРОБИОТЫ ШЛАКООТСТОЙНИКОВ

INVESTIGATION OF PHENOLOXIDIZING ACTIVITY OF BACTERIAL STRAINS OF MICROBIOTA OF SLAG SETTLEMENT PLANTS

Regina Zaytseva,

student, Biotechnology, East Siberia State University of Technology and Management (ESSUTM)

Russia, Ulan-Ude

Karina Sordonova

graduate student, Biotechnology East Siberia State University of Technology and Management (ESSUTM)

Russia, Ulan-Ude

Aryana Batorova

graduate student, Biotechnology East Siberia State University of Technology and Management (ESSUTM)

Russia, Ulan-Ude

Elena Sordonova

scientific supervisor, assistant professor, PhD, Department of Biotechnology, East Siberia State University of Technology and Management (ESSUTM)

Russia, Ulan-Ude

АННОТАЦИЯ

 В статье показано изучение фенолокисляющей активности нативной микробиоты шлакоотстойника газогенераторной станции. Изучение микробиоты показало наличие монокультур, обладающих деструктивными свойствами по отношению к фенолу, способных окислять до 99% присутствующего фенола. Изучены морфологические и фенолокисляющие свойства монокультуры бактерий-деструкторов фенола. В работе показана рациональность применения аборигенных монокультур для детоксикационных способов биологической очистки промышленных загрязнений

ABSTRACT

The article describes the study of phenol-oxidizing activity of native microbiota of slag trap of gas-generator plant. The study of microbiota showed the presence of monocultures with destructive properties in relation to phenol, capable of oxidizing up to 99% of the phenol present. Morphological and phenol-oxidizing properties of monocultures of phenol-degrading bacteria were studied. The paper demonstrates the rationality of using native monocultures for detoxification methods of biological treatment of industrial pollution.

Ключевые слова: фенолокисляющая активность, бактерии-деструкторы, фенол, промышленные загрязнения.

Keywords: phenol-oxidizing activity, degrading bacteria, phenol, industrial pollution.

Промышленные загрязнения сточных вод и большое количество существующих отстойников в настоящее время формирует не только экологические проблемы, но и токсикологические проблемы, связанные с высокой степенью промышленных токсикантов. Существующие способы захоронения, складирования, накопления в специальных зонах (отстойниках) показали низкую эффективность деструкции токсичных веществ, что приводит к проникновению токсикантов в окружающую среду и ассимилируют в биогеоценоз [3]. Примером загрязнения высокотоксичным веществом является существование «фенольного озера» в центре города Улан-Удэ. «Фенольное озеро» является результатом работы газогенераторной станции локомотиво-вагоноремонтного завода (ЛВРЗ) с 1987 года по 2005 год. За данный период стоки продуктов складировались на территории завода с образованием шлакоотстойника площадью 27 000 м², с глубиной от 2 до 4 метров. Экологи и местная общественность обеспокоены наличием высокотоксичного шлакоотстойника в черте города и акватории озера Байкал [5]. Безопасных методов рекультивации или утилизации данного «озера» на сегодняшний день не предложено и ведется активный поиск. Физико-химические, механические способы не приемлемы для решения данной проблемы. Поэтому поиск безопасных, экологически приемлемых способов утилизации является актуальной задачей для региона Байкальского акватория.

Одним из наиболее безопасных и эффективных методов очистки промышленных сточных вод и шлакоотстойников является биологический способ. В состав консорциумов микроорганизмов и простейших животных используемых для биотенков (аэротенков) входят культуры способные к ассимиляции различных по своей природе токсикантов [1]. Однако, высокотоксичные соединения зачастую бывают для данных консорциумов губительны, поэтому для промышленных загрязнений они не используются.

Самоочищение водоемов от фенольных соединений, в котором основную роль выполняют микроорганизмы, протекает медленно и малоэффективно [2]. Применение биотехнологических методов с использованием высокоэффективных биопрепаратов, содержащих чистые культуры микроорганизмов-деструкторов является приоритетным способом рекультивации [4].

Нативные микроорганизмы-деструкторы образуются путем естественной эволюции - в течение продолжительного времени, что позволяет микроорганизмам адаптироваться к химическому составу загрязненного биогеоценоза и климатическим условиям [6].

Исследование фенолокисляющей активности аборигенных микроорганизмов «фенольного озера» и изучение их характеристик является целью нашего исследования.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить состав микробиоты придонного слоя шлакоотстойника, выделив бактериологические штаммы нативных культур;

2. Исследовать фенолокисляющую активность выделенных штаммов;

3. Изучить морфологические характеристики фенолокисляющих микроорганизмов;

4. Исследовать фенолокисляющий потенциал полученных бактериальных штаммов на модельных твердых и жидких средах.

Объектом исследования являются аборигенные бактериальные штаммы, полученные из придонного слоя шлакоотстойника газогенераторной станции ЛВРЗ (г. Улан-Удэ).

Материалы и методы

Забор проб придонного слоя шлакоотстойников осуществляли согласно ГОСТ 17.4.4.02-2017. В ходе мониторинга придонных слоев шлакоотстойника были взяты и изучены образцы почвы и воды. Подсчет полученных культур клеток проводили методом Коха, на питательных пластинках.

Получение чистых культур аборигенных микроорганизмов посевом на агаризованную среду, с последующими пересевами. Окрашивание культур проводили методами Грама и Трухильо, микроскопирование при увеличении 15×100.

Фенолокисляющую активность бактерий исследовали по остаточному количеству фенола в модельной воде и химический анализ вод по определению массовых концентраций летучих фенолов проводили фотометрическим методом после отгонки с водным паром (ПНД Ф 14.1:2.105-97) [7].

Результаты и их обсуждение

В ходе исследования было выделено 12 культур, различных по морфологическим характеристикам, некоторые из которых обладали отличительной фенолокисляющей активность. Результаты морфологических характеристик представлены в таблице 1.

Таблица 1

Морфологические характеристики «чистых» культур почвенных микроорганизмов, населяющих приводную территорию шлаковых отстойников

Культивирование выделенных культур было проведено в качалочных колбах, на частоте вращения 180об/мин, на мясо-пептонном бульоне (МПБ) с водным раствором фенола с концентрацией 500мг/л, pH = 6,8-7,2, температура 22±2°С.

Рисунок 1. Фенолокисляющая активность микроорганизмов, полученных из аборигенной микрофлоры антропогенных микробиогеоценозов

По окончанию ферментации было определено остаточное количество фенола в питательной среде. Снижение содержания фенола в питательных средах наблюдалось во всех пробах на 5 сутки. 9 выделенных монокультур показал снижение содержания фенола до 10 мг/л, следственно процент деструкции составил 10 до 40%. И три культуры показали снижение содержания фенола до 0,2 мг/л. То есть, 99% фенола подверглось деструкции.

Монокультура 4 способна окислять до 99% фенола, что является крайне высоким показателем в сравнении с уже известными фенолокисляющими микроорганизмами, что и послужило выбором для дальнейших исследований.

На МПА образует бесцветные мелкие блестящие каплевидные цельные колонии, край гладкий, структура колонии однородная, диаметр молодой колонии 2-2,5 мм, старой - 3-5 мм. Пигмент не диффундирует в среду. Бактерии грамотрицательные, спорообразующие, короткие палочки 1,05×2,8 - 1,0×3,0 мкм, одиночные. В старых культурах палочки обычно короткие, мицелий не образует. Клетки слабо подвижные. Аэробы. В мясо-пептонном бульоне слизистая плёнка, умеренная муть, осадок скудный. Хорошо растёт в диапазоне рН среды 6,5-7,2, при температуре 15-25⁰С.

Рисунок 2. Снижение концентрации фенола в составе жидких питательных сред в зависимости от времени инкубирования микроорганизмов культуры 4

Деструктивную активность бактерий культуры №4 определяли во временных диапазонах 1, 3, 6, 24, 72 часа культивирования на качалке (100-150 об/мин) при температуре 22±2 ⁰С в жидкой среде МПБ с внесением 0,05 г  фенола на 100 г среды. Количество клеток в посевном материале соответствует значениям 11×10⁵ клеток. В качестве контролей сравнения использовали чистую среду МПБ, среду МПБ с культурой микроорганизмов.

Инкубирование фенолокисляющей культуры на жидких средах показало снижение концентрации остаточного фенола на 99% через 72 часа. Снижение содержания фенола в среде в течение 24 часов не превышало 50 %, что доказывает необходимость накопления биомассы для наибольшей деструкции фенола.

Следующим этапом работы была проверка влияния концентрации фенола в составе твердых питательных сред на рост фенолокисляющих бактерий. Анализ показал, что увеличение концентрации фенола до 0,025 %, полученную в результате замены воды на водный раствор фенола, подавления роста бактерий или изменение их морфологии не произошло (табл. 2).

Как видно из таблицы 2, музейная культура сравнения Bacillus subtills, не способна к росту на средах с концентрацией фенола в субстрате выше 0,01 %, тогда как изучаемая культура не проявляла признаков подавления роста на средах при значении концентрации фенола 0,0001, 0,001, 0,01 и 0,025%.

Таблица 2

Влияние концентрации фенола в составе твердых питательных сред на рост фенолокисляющих микроорганизмов

Изучение роста микроорганизмов на твердых фенолсодержащих средах, при концентрации фенола в среде 0,01%, показал замедление роста бактерий, появление обособленных колоний только на 3 сутки, а разрастание колоний на среде только на 5-7 сутки (табл. 3). При культивировании изучаемых бактерий на среде МПА рост и обособление колоний наблюдались через 24 часа.

Таблица 3

Влияние концентрации фенола в составе твердых питательных сред на рост фенолокисляющих бактерий

Первичная оценка фенолокисляющей активности выделенных аборигенных микроорганизмов антропогенных микробиогеоценозов показала высокий потенциал использования и дальнейшего изучения бактерий-деструкторов. Эволюционно развитые аборигенные микроорганизмы способны не только способствовать окислению экотоксикантов, но оказывать минимальное негативное воздействие на природный или антропогенный биогеоценоз в целом, что является одним из основных факторов безопасности применения микроорганизмов и их консорциумов.

Заключение

1) Микробиота придонных слоев отстойников-накопителей характеризуется небольшим разнообразием населяющих бактерий, характерных для почвенных микроорганизмов влажных зон.

2) Изучена фенолокисляющая активность выделенных микроорганизмов, показавшая наибольшее снижение содержания фенола культурой микроорганизмов пробы 4.

3) Изучение морфологических показателей фенолокисляющих микроорганизмов показало отсутствие негативного влияния концентраций фенола до 0,025% в средах.

4) Изучение фенолокисляющего потенциала выделенных микроорганизмов на модельных фенолсодержащих жидких и твердых средах показало возможность использования данных культур микроорганизмов для детоксикационных способов биологической очистки промышленных стоков и шлакоотстойников от агрессивных экотоксикантов.

Список литературы:

1. Алексеенко Э.И. Разработка технологии и аппаратурного оформления процесса биотехнологической очистки подземных фенольных загрязнений: автореф. дис. канд. техн. наук. – М., 2005. – 20 с.
2. Бирюков В.В., Музыченко JI.A. Лимитирование и ингибирование процессов роста и микробиологического синтеза. Научный центр биологических исследований АН СССР в Пущине, 1976. – С. 147 – 152.
3. Доусон Г., Мерсер Б. Обезвреживание токсичных отходов/Сокр. пер. с англ. В.А. Овчаренко. – М.: Строй-издат, 1996. – 288 с.: ил. – Пер. изд.: Hazardous Waste Management, John Wiley and Sons, Ync. USA, 1986.
4. Никоненко В.У., Чеховская Т.П., Федорик С.М. Биологическая деструкция фенола, формальдегида и нефтепродуктов в промышленных сточных водах // Химия и технология воды. – 1993. – Т. 5. – №5. – С. 251.
5. Самсонов А.Г. «Вся правда о фенольном озере». – 2014.  [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://gazeta-n1.ru/news/32380/
6. Соколова И. В., Колотова О. В., Владимцева И. В., Водовский Н. Б., Кочеткова Е. А. Исследование фенолокисляющих бактериальных штаммов, выделенных из акватории Северного Каспия // Вестник технологического университета. – 2017. – Т.20, №10. – С. 119 – 123.
7. ПНД Ф 14.1:2.105–97 – Методика выполнения измерений массовой концентрации летучих фенолов в придонных и очищенных сточных водах фотометрическим методом после отгонки водяным паром.