АНАЛИЗ ТАКСОНОМИЧЕСКОГО СОСТАВА МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА ЛИЦ С ОЖИРЕНИЕМ НА ФОНЕ ПРИЁМА BIFIDOBACTERIUMLONGUM С ПРИМЕНЕНИЕМ АНАЛИЗА АЛЬФА-РАЗНООБРАЗИЯ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА

ANALYSIS OF THE TAXONOMIC COMPOSITION OF THE INTESTINAL MICROBIOTA OF OBESE INDIVIDUALS ON THE BACKGROUND OF TAKING BIFIDOBACTERIUMLONGUM USING THE ANALYSIS OF THE ALPHA DIVERSITY OF THE INTESTINAL MICROBIOTA

Kabantsova Evgeniya Olegovna

Student, Voronezh State University,

Russia, Voronezh

Ключевые слова: микробиота, секвинирование, метагеномика, микроорганизмы, анализ данных, биоразнообразие.

Keywords: microbiota, sequencing, metagenomics, microorganisms, data analysis, biodiversity.

Альфа-разнообразие микробиомных сообществ

При изучении бактериальных сообществ методами высокопроизводительного секвенирования критически важным этапом является оценка их структуры, базирующаяся на анализе видового разнообразия и распределения таксонов. В современной микробной экологии под альфа-разнообразием понимают вариативность состава внутри конкретного образца. Для его количественной оценки используются индексы, учитывающие богатство (количество видов) и равномерность их распределения, такие как индексы Шеннона, Симпсона, Пилу и Chao1 [6, 7].

Одним из базовых показателей является число наблюдаемых видов (Observed species), которое отражает фактическое количество выявленных таксонов [2]. Его преимущество заключается в простоте интерпретации и отсутствии необходимости в сложных математических допущениях. Однако данный показатель ограничен глубиной секвенирования и не учитывает редкие, не попавшие в выборку виды [2].

В свою очередь, индекс Chao1 является непараметрическим методом оценки, позволяющим экстраполировать данные на ненаблюдаемые таксоны [1, 4]. Он опирается на анализ синглетонов и дублетонов, что позволяет компенсировать неполноту выборки и более точно оценить реальное богатство сообщества, особенно в случаях, когда в образце присутствует значительное количество редких микроорганизмов [1, 3].

Применение индекса Chao1 сопряжено с рядом методологических сложностей. Его значения сильно зависят от параметров предобработки данных, в частности от глубины разрежения (rarefaction) и стратегии фильтрации редких таксонов [3]. Возникает логическое противоречие: стандартные протоколы анализа микробиома предполагают удаление редких видов, тогда как Chao1 предназначен именно для их экстраполяции. Кроме того, допущение о равной вероятности обнаружения всех видов, лежащее в основе Chao1, зачастую не подтверждается эмпирически [5]. Несмотря на то, что Chao1 эффективен для оценки богатства при обилии редких таксонов, при высоком качестве секвенирования альтернативные метрики (ACE, Jackknife) или простое число наблюдаемых видов могут быть не менее информативны [1].

В свою очередь, индекс Шеннона (H') является комплексным показателем, объединяющим видовое богатство и равномерность распределения (evenness). В отличие от Chao1, он не пытается оценить ненаблюдаемое разнообразие, а фокусируется на численности выявленных видов, придавая определенный вес редким представителям [1]. С теоретической точки зрения H' отражает уровень неопределенности при идентификации случайно выбранной особи [4]. Типичные значения индекса варьируются от 1–2 до 3–5 в зависимости от сложности экосистемы.

Ключевым преимуществом индекса Шеннона является его устойчивость: он менее чувствителен к глубине разрежения и систематическим ошибкам обработки, чем Chao1, что позволяет достигать плато на кривых разрежения при меньшем объеме данных [4, 5]. Благодаря своей надежности и интерпретируемости, H' стал стандартом в микробиомных исследованиях. Тем не менее, он предполагает полноту выборки, поэтому при значительном различии в охвате проб результаты могут быть искажены [4]. В современной практике индекс Шеннона в сочетании с числом ASV/OTU и индексом Chao1 остается наиболее востребованным инструментом для оценки альфа-разнообразия.

Метод исследования: анализ альфа-разнообразия микробиоты кишечника

Для оценки внутривыборочного (альфа) разнообразия бактериальных сообществ кишечника применялся пакет vegan (версия 2.6-4) в среде статистических вычислений R (версия 4.5.1). Данный пакет является общепринятым стандартом в экологических и микробиомных исследованиях и предоставляет реализацию большинства классических метрик разнообразия, основанных на теоретико-информационных и вероятностных подходах.

В качестве метрик альфа-разнообразия использовались два показателя: наблюдаемое число таксонов (Observedfeatures, видовое богатство) и индекс Шеннона (Shannondiversityindex), отражающий совокупно богатство и выравненность сообщества.

В качестве входных данных использовалась таблица численностей ASV (AmpliconSequenceVariants), полученная после обработки данных высокопроизводительного секвенирования. Матрица была организована таким образом, что строки соответствовали образцам кишечного содержимого, а столбцы — отдельным ASV; значения ячеек представляли собой число прочтений соответствующего варианта в каждом образце.

Поскольку метрики альфа-разнообразия чувствительны к различиям в глубине секвенирования между образцами, перед расчётом проводилась процедура рарефакции (rarefaction) — случайного подвыборочного приведения всех образцов к единому числу прочтений, соответствующему минимальной глубине секвенирования среди образцов, прошедших контроль качества. Процедура выполнялась с помощью функцииrrarefy пакета vegan.

Соответствие распределения значений индексов нормальному закону проверялось с помощью теста Шапиро–Уилка. При анализе применялсянепараметрический критерий Манна–Уитни. График строился при помощи функции ggpLot.

Результаты и их обсуждение

Был проведен анализ альфа-разнообразия, используя меры разнообразия наблюдаемых видов и индекс Шеннона (рисунок 1). Выявлены статистически значимые различия по индексу Шеннона (2,77 ± 0,73 против 3,41 ± 0,55, p = 0,02) между кишечным микробиомом пациентов до и после приема пробиотической добавкисоответственно.

Рисунок 1. Альфа-разнообразие кишечного микробиома пациентов до и после приема пробиотической добавки. * p ≤ 0,05.

По метрике числа наблюдаемых видов статистически значимых различий между группами «до» и «после» приема пробиотической добавки выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии существенного изменения видового богатства как такового. В то же время по индексу Шеннона были установлены статистически значимые различия: значение индекса в группе до приема пробиотика составило 2,77±0,73, а после приема — 3,41±0,55 (p = 0,02). Полученный результат свидетельствует о том, что прием Bifidobacteriumlongum приводит к увеличению равномерности распределения видов в микробном сообществе, то есть к более сбалансированной структуре микробиоты кишечника, что традиционно рассматривается как признак улучшения её функционального состояния.

Список литературы:

1. Callahan B.J. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis / B.J. Callahan, P.J. McMurdie, S.P. Holmes, идр. // The ISME Journal. – 2017 – № 11 – P. 2639–2643.
2. Herrmann B. Accounting for uncertainties in biodiversity estimations: a new methodology and its application to the mesopelagic sound scattering layer of the high arctic / B. Herrmann, K. Cerbule, J. Brcic, идр. // Frontiers in Ecology and Evolution. – 2022 – № 10 – P. 775–759.
3. Kers J.G. The Power of Microbiome Studies: Some Considerations on Which Alpha and Beta Metrics to Use and How to Report Results / J.G. Kers, E. Saccenti // Frontiers in Microbiology. – 2022 – № 12 – P. 796025.
4. Kim B.R. Deciphering diversity indices for a better understanding of microbial communities / B.R. Kim, J. Shin, R.B. Guevarra, идр. // Journal of Microbiology and Biotechnology. – 2017 – № 27 – P. 2089–2093.
5. Peterson C. Analysis of Microbiome Data / C. Peterson, S. Saha, K. Do // Annual Review of Statistics and Its Application. – 2023 – № 11(1). P. 1-15.
6. Pruesse E. et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB //Nucleic acids research. – 2007. – Ɍ. 35. – №. 21. – P. 7188-7196.
7. Zheng J.J. MOCHI: a comprehensive cross-platform tool for amplicon-based microbiota analysis / J.J. Zheng, P.-W. Wang, T.-W. Huang, идр. // Bioinformatics. – 2022 – Q. 38, № 18 – P. 4286–4292.