СОСТОЯНИЕ  ФЕРМЕНТНОЙ  СИСТЕМЫ  ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗА  —  ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА  В  СЛЮНЕ  СТУДЕНТОВ  РАЗНЫХ  СТРАН

Кравченко  Денис

студент  стоматологического  факультета  Государственного  университета  медицины  и  фармации  им.  Н.  Тестемицану,  Молдова,  г.  Кишинёв

E -mail:  cravcencodns @mail.ru

Гаврилюк  Людмила  Александровна

научный  руководитель,  д-р  мед.  наук,  профессор,  ГУМиФ  им.  Н.  Тестемицану,  Молдова,  г.  Кишинёв

Социально-демографические  причины,  рост  случаев  инфицирования  через  кровь  многими  опасными  заболеваниями,  распространение  наркомании  способствуют  поиску  новых,  неинвазивных  и  безопасных  методов  диагностики  и  контроля  состояния  пациентов.  С  этой  точки  зрения  анализ  слюны  представляет  одну  из  альтернатив  анализу  крови.  Слюна  (ротовая  жидкость)  как  биологическая  жидкость  организма  отражает  состояние  метаболизма,  а  изменение  составляющих  её  компонентов  (бихимических  параметров)  может  иметь  клинико-диагностическое  значение  [1;  2;  3;  4].

Смешанная  слюна  выполняет  многообразные  функции  и  имеет  сложный  биохимический  состав.  Одной  из  важнейших  её  функций  является  антиоксидантная,  включающая  супероксиддисмутазу,  каталазу,  глутатионпероксидазу,  глутатионредуктазу,  глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу  и  др.  Водорастворимыйтрипептид,  глутатион,  является  важным  антиоксидантом,  который  в  организме  человека  находится  в  двух  формах:  окисленной  (GSSG)  и  восстановленной  (GSH).  Глутатион  постоянно  синтезируется  в  организме,  и  это  индивидуально  генетически  детерминировано.  Количество  глутатиона  у  людей  варьирует,  а  у  трети  населения  наблюдается  его  недостаточное  содержание  [5].  Восстановленный  глутатион  составляет  около  90—95  %  от  его  общего  внутриклеточного  содержания.  По  мнению  многих  исследователей  снижение  уровня  глутатиона  в  организме  может  привести  к  необратимым  последствиям  для  здоровья.  Функции  глутатиона  в  организме  многообразны:  он  инактивирует  вредные  для  организма  свободные  радикалы  кислорода,  которые  возникают  при  перекисном  окислении  липидов  клеточных  мембран,  является  коэнзимом  многих  глутатион-зависимых  ферментов,  способствует  выведению  из  организма  различных  токсинов  и  тяжёлых  металлов.

Единственным  энзимом,  основное  биологическое  значение  которого  заключается  в  поддержании  высокого  уровня  восстановленного  глутатиона  и  низкого  окисленного,  является  глутатионредуктаза,  катализирующая  реакцию:

GSSG  +  NADPH  +  H⁺ ®  2  GSH  +  NADP⁺ 

Для  нормального  функционирования  глутатионредуктазе  необходим  коэнзим  НАДФН,  который  генерирует  аэробный  путь  апотомического  окисления  глюкозы  —  пентозо-фосфатный  путь  (шунт). 

Целью  нашего  исследования  был  сравнительный  анализ  состояния  системы  глутатиоредуктаза  —  глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа  в  слюне  студентов,  рождённых  в  разных  странах  мира.

Материал  и  методы  исследования

В  исследовании  участвовали  47  здоровых  студентов  в  возрасте  20—23  года,  которые  были  распределены  на  четыре  группы:  1  —  молдаване  (Молдова);  2  —  евреи  (Израиль);  3  —  арабы  (Израиль);  4  —  африканцы.  В  процессе  иследования  были  соблюдены  все  этико-правовые  нормы.  Смешанную  слюну  (ротовую  жидкость)  собирали  утром,  центрифугировали  при  5000  оборотов/  мин  в  течение  10  минут.  Затем  с  помощью  спектрофотометрических  микрометодов  (DiaSysDiagnostics,  DE)  определяли  следующие  параметры:  активность  глутатионредуктазы  (ГР,  КФ  1.6.4.2)  методом  Horn  H.D.  [6],  глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы  (Г6ФДГ,  КФ  1.1.1.44)  методом  Noltman  E.A.  [7],  лактатдегидрогеназы  (ЛДГ,  КФ  1.1.1.27)  методом  Кузнецова  А.В.  [8],  содержание  восстановленного  глутатиона  методом  Sedlak  J.  [9]  и  содержание  общего  белка  методом  Lowry  O.H.  (1951).  Состав  слюны  варьирует  в  течение  суток,  поэтому,  необходимо  проводить  дополнительный  расчёт  полученных  результатов  относительно  содержания  белка  в  л  слюны,  что  является  более  информативным.  Полученные  результаты  статистически  обрабатывали  с  помощью  программы  Excel  и  Microsoft:Microstat  2007.  Коэффициенты  корреляции  рассчитывали  по  методу  Спирмена  [10].

Результаты  и  обсуждение

Все  студенты  были  без  воспалительных  процессов  тканей  ротовой  полости.  Исследование  содержания  общего  белка  показало  незначительное  различие  между  группами  студентов  (таблица  1).

Восстановленный  глутатион  (ВГ).  Содержание  ВГ  в  слюне  представлено  в  таблице  1.  Для  проведения  сравнительного  анализа  содержание  ВГ  в  слюне  студентов  первой  группы  было  принято  за  100  %.  По  отношению  к  показателю  первой  группы  у  студентов  второй  группы  содержание  ВГ  в  слюне  было  значительно  выше  как  при  расчёте  на  л  слюны  (184,9  %),  так  и  при  расчёте  на  г  белка  (185,6  %).  Также  повышенное  сожержание  ВГ  было  у  студентов  четвёртой  группы  в  л  слюны  (179,3  %)  и  относительно  г  белка  (223,4  %).  Только  у  студентов  третьей  группы  содержание  ВГ  в  слюне  было  значительно  ниже  как  в  расчёте  на  л  слюны  (64,1  %),  так  и  относительно  г  белка  (56,0  %).

Таблица  1.

Содержание  восстановленного  глутатиона  (ВГ)  и  белка  в  слюне  студентов

Глутатионредуктаза  (ГР).   В  расчёте  на  л  слюны  у  студентов  первой  группы  активность  была  равной  12,0  МЕ  (100  %),  у  студентов  второй  группы  —  20,6  МЕ  (171,7  %),  у  студентов  третьей  группы  —  38,3  МЕ  (319,2  %),  в  четвёртой  группе  —  29,1  МЕ  (242,5  %).  Удельная  активность  ГР,  представленная  на  рисунке  1,  также  была  повышенной  в  слюне  студентов  третьей  и  четвёртой  групп,  но  немного  ниже  (87,5  %)  активности  энзима  в  слюне  первой  группы.  ГР  является  НАДФН-зависимым  энзимом,  и  для  выполнения  её  внутриклеточной  функции  требуется  в  несколько  раз  больше  НАДФН,  чем  полиферментному  комплексу  биосинтеза  жирных  кислот  или  монооксигеназной  цепи  микросомального  окисления  (Cyt  P₄₅₀)  для  обезвреживания  токсических  веществ.

Рисунок  1.  Удельные  активности  ГР  и  Г6ФДГ  в  слюне  студентов  Серия  1  —  ГР;  серия  2  —  Г6ФДГ.  1,  2,  3,  4  —  группы  студентов

ГР  связывает  энзиматическое  разрушение  перекисей,  образующихся  в  организме,  с  пентозофосфатным  путём  метаболизма  глюкозы,  одним  из  ключевых  ферментов  которого  является  глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа  (Г6ФДГ).  Активность  энзима  была  повышенной  во  второй  —  18,7  МЕ/л  (283,3  %),  третьей  —  8,9  МЕ/л  (134,8  %)  и  четвёртой  —  13,1  МЕ/л  (198,5  %)  группах  по  сравнению  с  активностью  Г6ФДГ  в  слюне  студентов  первой  группы  (6,6  МЕ/л).  Удельная  активность  энзима  была  повышенной  у  студентов  второй  группы  и  четвёртой  (рисунок  1).  В  третьей  группе  удельная  активность  энзима  в  слюне  была  соразмерна  активности  Г6ФДГ  у  студентов  первой  группы  (108,1  %).  Пентозофосфатный  путь  генерирует  НАДФН,  необходимый  для  обезвреживания  токсинов  монооксигеназной  цепью  микросомального  окисления,  синтеза  жирных  кислот  и  липидов,  стероидных  гормонов,  провитамина  D.  Полученные  результаты  активности  Г6ФДГ  в  слюне  свидетельствуют  о  более  активных  анаболических  процессах  в  организме  студентов  второй  и  четвёртой  групп,  по  сравнению  со  студентами  первой  и  третьей.  Пентозофосфатный  путь  (шунт)  связан  с  дихотомическим  путём  окисления  глюкозы,  гликолизом,  одним  из  ключевых  ферментов  которого  является  лактатдегидрогеназа.

Лактатдегидрогеназа  (ЛДГ).  На  рисунке  2  представлена  активность  ЛДГ  в  расчёте  на  л  слюны  и  на  г  белка  (удельная  активность).  Как  видно  из  рисунка,  активность  ЛДГ  в  слюне  у  студентов  первой  группы  была  выше  активностиэнзима  у  студентов  всех  остальных  групп  при  обоих  способах  расчёта. 

Рисунок  2.  Активность  ЛДГ  в  слюне  студентов  А  —  активность:  серия  1  —  МЕ/л;  серия  2  —  МЕ/г  белка

Корреляционный  анализ.  Принимая  во  внимание,  что  ГР,  Г6ФДГ  и  ЛДГ  являются  функционально  связанными  энзимами,  было  решено  рассмотреть  их  взаимоотношения  у  студентов  (таблица  2).  Результаты  корреляционного  анализа  Спирмена  показали  тесную  взаимосвязь  между  ГР  и  Г6ФДГ  у  студентов  первой,  второй  и  четвёртой  групп,  в  третьей  группе  эта  связь  была  нарушена  (P_t>0,05).  Однако,  функциональная  взаимосвязь  между  ГР  и  ВГ  была  найдена  только  в  третьей  группе  (P_t<0,0025).  У  студентов  первой  и  третьей  групп  была  найдена  тесная  функциональная  связь  между  Г6ФДГ  и  ЛДГ.  Таким  образом,  поиск  корреляционных  отношений  между  энзимами  и  ВГ  с  применением  непараметрического  критерия  Спирмена  показал,  что  эта  функциональная  взаимосвязь  не  всегда  является  тесной  даже  у  практически  здоровых  людей.  По-видимому,  модификации  взаимоотношений  этих  энзимов  отражают  метаболический  статус  организма  здоровых  студентов  из  разных  стран.

Таблица  2.

Корреляционные  взаимоотношения  энзимов  и  глутатиона  в  слюне  студентов

Примечание.  В  скобках  указано  количество  студентов

Принимая  во  внимание  молодой  возраст  студентов,  не  вызывает  особых  вопросов  повышение  активности  ГР  и  Г6ФДГ  в  слюне,  что  может  свидетельствовать  об  активных  анаболических  процессах  в  их  организме.  Возможно,  в  первой  группе  студентов  наблюдалось  незначительное  повышение,  в  пределах  нормы,  активности  ЛДГ  в  сравнении  с  другими  группами.  На  основании  полученных  результатов  можно  сделать  следующие  выводы:

1.  Различия  в  активности  энзимов  и  восстановленного  глутатиона  в  слюне  студентов  из  разных  стран,  вероятно,  являются  генетически  детерминированными.

2.  Результаты  проведённого  корреляционного  анализа  с  применением  непараметрического  критерия  Спирмена  не  показали  функциональную  тесную  взаимосвязь  между  всеми  рассмотренными  параметрами,  что  может  свидетельствовать  о  модификациях  метаболических  процессов  в  растущем  организме.

Список  литературы:

1.Григорьев  И.В.,  Чиркин  А.А.  Роль  биохимического  исследования  слюны  в  диагностике  заболеваний.  //Клин.  Лаб.  Диагностика.  —  1998.  —  №  6  —  С.  18—20. 

2.Гублер  Е.В.,  Генкин  А.А.  Применение  непараметрических  критериев  статистики  в  медико-биологических  исследованиях.  М:  Наука,  1973.

3.Horn  H.D.  Glutathione  reductase.  In:  Bergmeyer,  H.-U.  Ed.  Methods  of  enzymatic  analysis.  New  York:  Academic  Press,  1963.  —  p.  875—879.

4.Kuznetsov  A.V.,  Gnaider  E.  Laboratory  protocol  lactate  dehydrogenase  cytosolic  marker  enzyme.//  Mitochondrial  Physiology  Network.  —  2010.  —  vol.  8.  —  №  18.  —  p.  1—8.

5.Liu  J.,  Duan  Y.  Saliva:  a  potential  media  for  disease  diagnostics  and  monitoring.//  Oral  Oncol.  —  2012.  —  vol.  48.  —  №  7.  —  p.  567—577.

6.NazzarenoBallatori,  Suzame  M.  Kpance,  Sylvia  Notenboom,  Shujie  Shi,  Kim  Tieu,  Cristine  L.  Hammond.  Glutathione  dysregulation  and  the  etiology  and  progression  of  human  diseases.//  Biol.  Chem.-2009.  —  vol.  390.  —  №  3.  —  p.  191—214.

7.Noltman  E.A.,  Gubler  G.J.,  Kubby  S.A.  Enzymatic  Assay  of  Glucose-6-Phosphate  Dehydrogenase.//  J.  Biol.  Chem.  —  1961.  —  №  236.  —  p.  1225—1230.

8.Schafer  C.A.,  Schafer  J.J.,  Yakob  M.,  Lima  P.,  Camargo  P.,  Wong  D.T.  Saliva  diagnostics:  utilizing  oral  fluids  to  determine  health  status.//  Monogr.  Oral  Sci.  —  2014.  —  №  24.  —  p.  88—98.

9.Sedlak  J.,  Lindsay  R.H.  Estimation  of  total  protein-bound,  and  nonprotein  sulfhydryl  groups  in  tissue  with  Ellman’s  reagent.//  Anal.  Biochem.  —  1968.  —  vol.  25.  —  №  1.  —  p.  192—205.

10.Todorovic  T.,  Dozic  I.,  Pavlica  D.,  Marcovic  D.,  Brajovic  G.,  Ivanovic  M.,  Stevanovic  G.,  Mircovic  S.,  Andjelski  B.//  J.  Calif.  Dent.  Assoc.  —  2013.  —  vol.  41.  —  №  2.  —  p.  107—109;  112.