ОСОБЕННОСТИ  НАКОПЛЕНИЯ  ФЕНОЛКАРБОНОВЫХ  КИСЛОТ  СУСПЕНЗИОННОЙ  КУЛЬТУРОЙ  ПАЖИТНИКА  ГРЕЧЕСКОГО  В  ХОДЕ  РОСТОВОГО  ЦИКЛА

Драгун  Полина  Алексеевна

студент  5  курса,  кафедра  клеточной  биологии  и  биоинженерии  растений  БГУ,  Республика  Беларусь,  г.  Минск

E-mail: 

Логвина  Анна  Олеговна

научный  руководитель,  ассистент  кафедры  клеточной  биологии  и  биоинженерии  растений  БГУ,  Республика  Беларусь,  г.  Минск

В  настоящее  время  важными  для  изучения  становятся  растения,  являющиеся  активными  продуцентами  фенольных  соединений.  Препараты  на  основе  фенольных  соединений  используются  в  качестве  антимикробных,  противовоспалительных,  желчегонных,  диуретических,  гипотензивных,  тонизирующих,  вяжущих  и  слабительных  средств  [4,  с.  192].  Пажитник  греческий  (Trigonella  foenum-graecum  L.)  является  одним  из  древнейших  культивируемых  лекарственных  растений,  эффективность  применения  которого  в  профилактике  и  лечении  многих  заболеваний  является  установленной.  Многочисленные  исследования  свидетельствуют  о  высоком  содержании  фенольных  соединений  в  экстрактах  листьев  и  семян  пажитника  греческого,  что  создает  предпосылки  для  промышленного  получения  на  его  основе  указанных  метаболитов.  Однако  для  удовлетворения  потребностей  фармацевтических  производств  в  получении  целевого  продукта  требуется  значительный  объем  исходного  сырья,  при  этом  ареал  пажитника  ограничен  климатическими  условиями  [1,  c.  100—160].  Поэтому  актуальной  задачей  является  разработка  альтернативных  способов  получения  растительного  сырья  из  пажитника  греческого,  среди  которых  применение  биотехнологического  метода  культуры  клеток  и  тканей  растений  видится  многообещающим.

В  промышленной  биотехнологии  преимущественно  используются  суспензионные  культуры,  но  для  того  чтобы  их  использование  для  получения  метаболитов  «интереса»  было  экономически  оправданным,  они  должны  характеризоваться  высокой  продуктивностью  по  синтезируемым  целевым  соединениям,  которая  может  значительно  варьировать  в  зависимости  от  стадии  ростового  цикла.  А  поскольку  фенолкарбоновые  кислоты  составляют  основу  фенольного  комплекса  клеточных  культур  пажитника  греческого  [6,  с.  384—385],  то  важным  этапом  исследования  суспензии  является  определение  динамики  изменения  содержания  данных  соединений,  причем  не  только  в  самой  клеточной  биомассе,  но  в  среде  инкубации  в  связи  с  возможностью  их  экскреции  клетками.

Целью  данной  работы  было  изучить  динамику  накопления  фенолкарбоновых  кислот  суспендированными  клетками  пажитника  греческого  и  характер  изменения  содержания  данных  метаболитов  в  среде  культивирования.

Объектом  изучения  служила  суспензионная  культура  пажитника  греческого,  инициированная  из  гетеротрофного  каллуса  листового  происхождения  пажитника  ярового  сорта  Ovari  4  [5,  с.  29—37].  Для  инициации  и  последующего  культивирования  суспензии  использовали  жидкую  питательную  среду,  соответствующую  по  составу  среде,  используемой  для  выращивания  исходной  каллусной  ткани.  Так,  среду,  минеральная  основа  которой  соответствовала  среде  Мурасиге  и  Скуга,  дополняли  4  %  сахарозы  и  регуляторами  роста:  1,0  мг/л  2,4-дихлорфеноксиуксусной  кислоты,  2,0  мг/л  кинетина  и  2,0  мг/л  индолил-3-уксусной  кислоты  [5,  с.  29—37].  Суспензию  культивировали  в  темноте  при  комнатной  температуре  на  круговой  качалке  со  скоростью  100—120  об/мин  [3,  с.  22].

Общее  содержание  фенолкарбоновых  кислот  в  суспензии  клеток  и  в  среде  инкубации  определяли  методом  прямой  спектрофотометрии  [2,  c.  99—104]  на  4-е,  7-е,  11-е,  14-е,  18-е,  21-е,  24-е,  28-е  сут  культивирования,  выражали  в  эквиваленте  галловой  кислоты  и  пересчитывали  на  г  сухой  массы  суспензии  (мг/г  сухой  массы)  [7,  c.  3964—3974].

Изучение  динамики  накопления  фенолкарбоновых  кислот  в  процессе  культивирования  суспензии  клеток  пажитника  греческого  показало,  что  в  ходе  латентной  фазы  роста  содержание  фенолкарбоновых  кислот  в  культуре  составляло  10,8  мг/г  сухой  массы  (рисунок  1).

Рисунок  1.  Динамика  изменения  содержания  фенолкарбоновых  кислот  в  суспензионной  культуре  пажитника  греческого  в  процессе  культивирования

К  11  сут.  ростового  цикла  суспензии  происходило  снижение  уровня  накопления  метаболитов  данной  группы  до  8,0  мг/г  сухой  массы.  Однако  уже  к  14  сут.  культивирования  наблюдалось  повышение  активности  синтеза  фенолкарбоновых  кислот,  так,  что  к  24  сут.  (стационарная  фаза  роста)  их  содержание  составило  10,9  мг/г  сухой  массы.

Также  была  определена  динамика  накопления  фенолкарбоновых  кислот  в  среде  культивирования  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  на  разных  этапах  ростового  цикла  (рисунок  2).

Показано,  что  в  ходе  ростового  цикла  суспензионной  культуры  пажитника  греческого  наибольшее  количество  фенолкарбоновых  кислот  выделялось  в  среду  культивирования  на  4  сут.  ростового  цикла.  Их  содержание  достигало  68,3  мг/г  сухой  массы,  что  более  чем  в  6  раз  выше,  чем  в  самих  клетках  на  этой  же  стадии  роста.  К  14  сут.  значение  показателя  снижалось  до  1,99  мг/г.  После  уровень  накопления  фенолкарбоновых  кислот  возрастал,  но  незначительно,  и  к  21  сут.  снизился  до  минимального  значения,  равного  0,21  мг/г. 

Рисунок  2.  Динамика  накопления  фенолкарбоновых  кислот  в  среде  культивирования  суспензионной  культуры  пажитника  греческого

Если  же  сравнивать  динамику  накопления  фенолкарбоновых  кислот  в  среде  культивирования  и  в  самой  суспензионной  культуре  пажитника  греческого,  то  можно  утверждать,  что  наиболее  высокая  активность  синтеза  данных  метаболитов  приходится  на  латентную  фазу  роста,  при  этом,  должно  быть,  преимущественно  образуются  соединения  сравнительно  простой  структуры,  легко  покидающие  клетки  и  детектируемые  в  среде  культивирования.  Тогда  как  в  процессе  роста  уровень  выделяемых  свободных  фенолкарбоновых  кислот  снижается,  что  может  быть  связано  с  их  преобразованием  в  более  сложные  метаболиты  фенольной  природы,  в  частности  в  результате  реакций  конденсации  или  гликозилирования,  либо  же  с  синтезом  на  их  основе  других  групп  фенолов,  например,  флавоноидов.

Таким  образом,  на  основании  представленных  данных  можно  заключить,  что  наиболее  высокое  значение  уровня  накопления  фенолкарбоновых  кислот  в  среде  культивирования  и  в  самой  суспензионной  культуре  пажитника  греческого  приходится  на  латентную  фазу  роста  (4  сут.).  Снижение  содержания  фенолкарбоновых  кислот  в  среде,  наблюдающееся  в  течение  роста  культуры,  свидетельствует  о  том,  что  на  более  поздних  стадиях  ростового  цикла  синтезируются  фенолкарбоновые  кислоты,  накапливающиеся  преимущественно  внутри  клеток.

Список  литературы:

1.Бутенко  Р.Г.  Биология  клеток  высших  растений  in  vitro  и  биотехнологии  на  их  основе:  учеб.  пособие/  Р.Г.  Бутенко.  М.:  ФБК-ПРЕСС,  1999.  —  160  с.

2.Гаврилин  М.В.  Фенольные  соединения  надземной  части  шалфея  мускатного  (Salvia  sclarea  L.),  культивируемого  в  Ставропольском  крае  //  М.В.  Гаврилин,  О.И.  Попова.,  Е.А.  Губанова.  Химия  растительного  сырья.  —  2010.  —  №  4.  —  С.  99—104.

3.Дитченко  Т.И.  Культура  клеток,  тканей  и  органов  растений:  методические  рекомендации  к  лабораторным  занятиям  /  Т.И.  Дитченко.  Мн.:  БГУ,  200  —  22  c.

4.Племенков  В.В.  Введение  в  химию  природных  соединений.  Казань,  2001  —  376  с.

5.Lohvina  H.O.,  Makai  S.,  Ditchenko  T.I.,  Reshetnikov  v.N.,  Spiridovich  E.v.,  Yurin  v.  M.  Induction  of  callus  from  leaves  and  stems  of  Trigonella  foenum-graecum  varieties  //  Acta  Agronomica  Óváriensis.  —  2012.  —  v.  54  (2).  —  P.  29—37.

6.Lohvina  H.O.,  Yurin  v.M.  Phenolics  and  antioxidant  potential  of  fenugreek  cell  cultures  //  Book  of  Abstracts  of  The  17th  International  Pushchino  School  Conference  of  Young  Scientist  «Biology  —  The  Science  of  The  XXI  Century»,  Pushchino,  Russia.  April  21—26th.  2013.  —  P.  384—385.

7.Parthasarathy  S.,  Azizi  J.B.,  Ramanathan  S.,  Ismail  S.,  Sasidharan  S.,  Said  M.I.M.,  Mansor  S.M.  Evaluation  of  antioxidant  and  antibacterial  activities  of  aqueous,  methanolic  and  alkaloid  extracts  from  Mitragyna  Speciosa  (Rubiaceae  Family)  leaves  //  Molecules.  —  2009.  —  Vol.  14  (10).  —  P.  3964—3974.