ПЦР-ТЕСТ СИСТЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ФАКТОРОВ ПЕРСИСТЕНЦИИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

В настоящее время для определения безопасности пищи для организма человека необходима экспертиза питьевой воды и пищевых продуктов, произвести которую можно только в лабораторных условиях. В результате проведения исследований устанавливается наличие патогенных микроорганизмов в составе продуктов питания. В то время как проектируемая нами ПЦР тест-система направлена не только на выявление возможно-болезнетворных видов микроорганизмов, но и на определение их болезнетворного потенциала, прежде всего – основных факторов персистенции микроорганизмов по отношению к организму хозяина, таких как антилизоцимная активность и продукция аэробактинов. Осуществляется прямое определение наличия возбудителей путем выявления специфического участка ДНК возбудителя (а не продуктов его жизнедеятельности), что дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции [8, c.41-55]. Данный метод исследования обладает высокой специфичностью – выявляется уникальный фрагмент ДНК, специфичный для данного возбудителя, и отсутствуют ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. Экстремальная чувствительность реакции, обеспечиваемая выявлением даже единичных клеток возбудителей, позволяет использовать ПЦР в тех случаях, когда другие методы диагностики не дают положительного результата [4, c. 38].

Материалы и методы: Для исследования были использованы модельные штаммы и клинические изоляты трёх видов энтеробактерий: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, и Salmonella enterica сероваров Enteritidis и Typhimurium из коллекции штаммов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза, идентифицированных по морфологическим, культуральным и биохимическим (с помощью тест-системы «АНАЭРО-тест 23», «LaСhema», Чехия) свойствам [6, c. 3019–3028; 7, c. 307–314].

С целью создания экспресс тест-системы скринингового выявления генетических детерминант секретируемых ингибиторов лизоцима методом ПЦР [5, c. 8-13], был произведен подбор праймеров видоспецифичного диапазона к генетическим детерминантам ингибиторов лизоцима, но, в отличие от предыдущей работы, производилось выявление гомологов генов iucA, iucB, iucC и pliC праймерными парами, локализованными на расстоянии не более 208 нуклеотидов.

Выделение матричной ДНК для амплификации проводилось путем внесения 2-10 мкл бактериальной массы чистой культуры каждого исследуемого штамма в 0,1 мл смеси реагентов «ДНК-Экспресс» (НПФ «Литех», Россия) с последующим нагреванием до температуры 98°С в течение 20 мин в программируемом твердотельном термостате «Терцик МС-2» (НПФ «ДНК-тенология», Россия), после чего производилось центрифугирование в микроцентрифуге «5415 D» («Eppendorf», Германия) при 16100 g в течение 0,5 мин при комнатной температуре. Полученный супернатант вносился в предварительно подготовленную реакционную смесь для ПЦР в объеме 5 мкл.

Реакционная смесь для ПЦР в объеме 15 мкл приготовлялась из набора праймеров и реагентов ООО «Синтол» в составе: 2 мкл 25 мM раствора магния хлорида, 2 мкл 10-кратного ПЦР-буфера Б, 1,6 мкл 2,5 мM раствора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, 0,5 мкл 10 мкМ смеси праймеров, 0,2 мкл 5 ед/мкл раствора Taq-полимеразы и 8,7 мкл деионизованной воды. С целью предотвращения испарения воды из реакционной смеси, на её поверхность наслаивалось 20-30 мкл стерильного парафинового масла. Реакция проводилась в ДНК-амплификаторе «Терцик МС-2» в режиме ускоренного регулирования температуры в течение 30 циклов при температуре отжига 65°C для праймерных пар ко всем вышеуказанным маркерным последовательностям.

Получаемые ампликоны подвергались агарозному гель-электрофорезу [3, c. 159-168]. Регистрация результатов производилась на основе наличия либо отсутствия полос люминесценции бромида этидия в агарозном геле, расположенных в диапазоне молекулярных масс, соответствующих локализации маркерных фрагментов до 208 нуклеотидных пар.

Результаты и обсуждение: Применение тест-системы с праймерами к аэробактинам подтвердило наличие всех трёх генов, выявляемых у клебсиелл – носителей мегаплазмиды вирулентности (штаммы K75, K76, K77, K78), а также позволило выявить один клинический изолят от пациента с I – II степенью дисбиоза кишечника (штамм E55). Разделение полученных ампликонов параллельно с маркером молекулярных масс подтвердило специфичность реакции амплификации (рис. 1): молекулярная масса ампликонов полностью соответствовала ожидаемому диапазону.

Рис. 1 Фореграмма результатов разделения ампликонов трёх генов аэробактинов (iucABC) с двумя тест-штаммов (K78, E55) в агарозном геле вместе с маркером молекулярных масс pBS/MspI. Н.п. – нуклеотидные пары.

Проведение ПЦР с использованием праймеров к гену секретируемого ингибитора лизоцима pliC позволило зарегистрировать наличие его гомологов, выявляемых у клебсиелл-носителей мегаплазмиды вирулентности (штаммы К75, К76, К77) и у сальмонелл (штаммы S1, S2, S3, S4, S5, S6). Молекулярная масса полученных ампликонов также соответствовала ожидаемым значениям, установленным также в ходе более ранних работ [1, c.302–311; 2, c.342]. Для верификации специфичности реакции в качестве отрицательных контролей был использован бесплазмидный штамм Klebsiella pneumoniae К74 для плазмидного гомолога гена pliC клебсиелл и вышеуказанный штамм K77 для хромосомного гомолога гена pliC сальмонелл (рис 2). При этом наличие положительной реакции со всеми имеющимися штаммами сальмонелл может позволить использовать данный маркер и в качестве видового идентификатора Salmonella enterica.

Рис. 2 Фореграмма результатов реакции амплификации двух гомологов генов ингибитора лизоцима pliC-K и pliC-S с тест-штаммами клебсиелл и сальмонелл соответственно.

Работа выполнена при грантовой поддержке фонда содействия развития малых форм предприятий в научно-технической сфере.

Список литературы:

1. Андрющенко С.В., Перунова Н.Б., Бухарин О.В. Гомологи гена периплазматического ингибитора лизоцима PliC и их роль в антилизоцимной активности энтеробактерий // Микробиология. 2013. №3. Т.83.
2. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина, 1999.
3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование// М.: Мир, 1984.
4. Организация работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности: Методические указания. – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.
5. Перунова Н.Б., Андрющенко С.В., Бухарин О.В. Генетические детерминанты секретируемых ингибиторов лизоцима и антилизоцимный фенотип энтеробактерий // Журн. микробиол. 2012, №60.
6. Analytical comparison of nine PCR primer sets designed to detect the presence of Escherichia coli/Shigella in water samples / /Water Research Volume 43, Issue 12, July 2009
7. Detection of coliform bacteria in water by polymerase chain reaction and gene probes/ / Appl Environ Microbiol. 1990 Feb; 56(2).
8. Mats M., Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step –out PCR // Generation of cDNA libraries: Methods and protocols (Shao-Yao Ying Ed.) Humana press, 1999, 27:1558-1560.