РАЗРАБОТКА ИФА ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ МАНХЕЙМИОЗА КРС

Введение. Респираторные болезни молодняка КРС являются одной из наиболее важных причин экономического ущерба в животноводстве, приводят к падежу или снижению скорости роста больных животных, затратам на лечение, диагностические и профилактические мероприятия [2].

В возникновении бронхопневмоний большую роль играют представители семейства Pasteurellaceae (Pasteurella multocida и Mannheimia (Pasteurella) haemolytica): грамотрицательные, факультативно анаэробные палочкообразные бактерии, являющиеся комменсальными обитателями поверхности слизистых оболочек верхнего респираторного тракта, способные вызывать вторичные инфекции и болезни у КРС.

Основным звеном в системе мер профилактики и борьбы с данными заболеваниями является вакцинация, оценка эффективности которой предполагает определение уровня специфических антител в сыворотках крови вакцинированных животных. Обнаружение антител у не вакцинированных животных свидетельствует о возможной циркуляции в стаде возбудителя.

В настоящее для серодиагностики широко используется иммуноферментный анализ (ИФА), который превосходит традиционные методы диагностики (РА, РСК, РДП) по чувствительности, специфичности и производительности, возможности стандартизации условий постановки анализа, доступности широкому кругу практических учреждений [1].

Целью работы являлось разработка непрямого варианта иммуноферментного анализа для выявления антител к липополисахариду (ЛПС) Mannheimia haemolytica в сыворотках крови крупного рогатого скота.

Материалы и методы.

Антиген. В качестве антигена для ИФА использовали 18-24 - часовую культуру штамма Mannheimia haemolytica из коллекции штаммов ATCC № 29696, выращенную на плотной питательной среде - 1,5% перевар по Хотингеру с добавлением 10% эктракта эритроцитов лошади. Липополисахаридный антиген (ЛПС-АГ) получали методом фенольно-водной экстракции. Соматический антиген (О-АГ) был получен по методике, описанном Gunnarsson A. Et al [4]. Жгутиковый антиген (Н-АГ) получали по методу Robison H.F.et al [5].

Конъюгат. Антивидовой пероксидазный коньюгат против IgG1 быка (ИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва);

Сыворотки крови. В работе использовали сыворотки крови, полученные от КРС различных возрастных групп.

ИФА. Постановку ИФА проводили как с использованием разработанной нами тест-системы Н-ИФА - «ВНИИЗЖ», так и с помощью коммерческой тест-системы «Mannheimia haemolytica ELISA KIT» (BIOX, Бельгия).

Одним из важных этапов при разработке ИФА является получение активного и специфичного антигена [3]. В непрямом варианте ИФА были исследованы следующие полученные нами антигены: ЛПС-АГ, Н-АГ, О-АГ. При сравнительной оценке активности антигенов в ИФА наиболее высокий уровень специфичности регистрировали с ЛПС-АГ, полученным методом фенольно-водной экстракции.

Разработка тест-системы ИФА предполагает подбор наиболее подходящих буферных систем с оптимальной ионной силой для сорбции антигена на планшеты, блокирующих растворов, а также определение времени адсорбции компонентов реакции и температурного режима.

В результате проделанной работы были оптимизированы условия проведения Н-ИФА а именно: в качестве блокирующего раствора использовали 1% сухое  обезжиренное молоко («Marvel»), для разведения сыворотки и контролей -0,1% сухое молоко. Постановку ИФА проводили по общепринятой схеме в объеме 50 мкл на лунку. В качестве субстрат-хромагенного раствора использовали раствор ABTS. Учет реакции- с применением спектрофотометра Tecan (Австрия) при длине волны 405 нм.

С помощью разработанного метода и коммерческой тест-системы провели исследование 174 полевых сывороток крови от КРС в том числе от иммунизированных животных, не иммунизированных животных и переболевших, полученных из 10 различных хозяйств и 4 регионов РФ, где был выделен возбудитель Mannheimia haemolytica.

Результаты тестирования частично представлены в таблице.

Таблица 1.

Результаты исследования сыворотоккрови КРС в ИФА

Примечание: * Интерпретация результатов разработанной тест-системы Н-ИФА- «ВНИИЗЖ» титр сыворотки: <1:20-отрицательно,> 1:20-положительно;

**- ИФА-BIOX - результаты исследования сывороток с помощью коммерческого набора.

Проведенные исследования показали, что процент совпадения результатов Н-ИФА с коммерческой тест-системой составил-93%.

Заключение.

Впервые в России разработана иммуноферментная тест-система на основе ЛПС антигена для выявления специфических антител в сыворотках крови к Mannheimia haemolytica КРС. При этом получены специфические компоненты, установлены величины пороговых показателей, Проведена сравнительная оценка результатов исследований сывороток крови КРС, с использованием разработанной иммуноферментной тест-системы и коммерческого иммуноферментного набора зарубежного производства.

Список литературы:

1. Егоров А.М. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М. Егоров, А.П. Оленов, Е.М. Гаврилева. М.: Высш. Шк., 1991. 288 с.
2. Инфекционные болезни животных/ Б. Ф. Бессарабов, А. А. Вашутин, Е. С. Воронин и др.; Под ред. А. А. Сидорчук.- М.: КолосС, 2007. – 671с., [18] л. Ил. – (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. Учеб, заведений).
3. Quantification of Mannheimia haemolytica leukotoxin by indirect ELISA// J Vet Res.-2006.-Vol.73(4).-P.241-250.
4. Gunnarsson, A. Serologic studies on porcine strain: agglutination reactions/ A. Gunnarsson, E.L. Biberstein.B. Hurvell// Am.J. Vet.Res. 1977. Vol.38, №8. P.1111-1114.
5. Robison, H.F. Microbial diseas / H.F. Robison //Anal. Biochem. 1983. Vol. 64.P.210-214.