ИССЛЕДОВАНИЕ  ШИЗОНЕПЕТЫ  МНОГОНАДРЕЗАННОЙ  В  КАЧЕСТВЕ  ИСТОЧНИКА  АНТИОКСИДАНТОВ

Сердюков  Данил  Сергеевич

студент  4  курса  кафедры  химии  Хакасского  государственного  университета  им.  Н.Ф.  Катанова,  г.  Абакан

E-mail:  aszx12311@rambler.ru

Мухина  Елена  Савельевна

научный  руководитель,  канд.  хим.  наук,  доцент  Хакасского  государственного  университета  им.  Н.Ф.  Катанова,  г.  Абакан

Быстрое  развитие  научно-технического  прогресса  накладывает  большой  негативный  отпечаток  на  экологическую  обстановку  как  локально  в  крупных  промышленных  городах,  так  и  во  всей  биосфере  в  целом.  Воздействие  стрессов  (электромагнитное  и  шумовое  загрязнения,  ионизирующее  излучение,  химические  выбросы,  синтетические  фармацевтические  препараты  и  добавки  к  пище  и  др.)  индуцирует  окислительный  стресс  в  живых  системах  и  требует  от  них  значительных  адаптационных  ресурсов.  Это  в  первую  очередь  относится  к  человеку.  Резистентность  к  ряду  негативных  факторов  внутренней  и  внешней  среды  можно  повысить,  используя  биологически  активные  вещества  (БАВ)  естественного  происхождения,  обладающие  антиоксидантными  свойствами.  Большое  количество  ценных  в  этом  отношении  веществ  (витамины  и  провитамины,  микроэлементы,  флавоноиды  и  др.)  несёт  в  себе  растительное  сырьё,  которое  к  тому  же  высоко  доступно  и  представлено  многими  видами,  содержащими  в  общей  сложности  тысячи  индивидуальных  компонентов. 

Наиболее  видное  место  среди  растительных  антиокислительных  БАВ,  пожалуй,  принадлежит  флавоноидам  —  обширной  группе  фенольных  соединений,  включающих  дифенилпропановую  структуру  [10].  Они  содержатся  практически  в  каждом  растении,  и  на  данный  момент  их  идентифицировано  более  4000  [22]. 

По  воздействию  на  организм  животных  и  человека  для  флавоноидов  установлено  противомикробное,  противовоспалительное,  противораковое  [3,  7,  11],  спазмолитическое  и  нейропротекторное  [24]  действие.  Как  антиоксиданты  флавоноиды  зачастую  более  сильные  в  сравнении  с  β-каротином,  витаминами  С  и  Е.  Они  могут  также  играть  защитную  роль  в  организме  по  отношению  к  другим  важным  веществам  [15]. 

  Существенным  является  синергизм  действия  флавоноидов  и  типичного  антиоксиданта-витамина  —  аскорбиновой  кислоты  (АК)  в  регуляции  окислительно-восстановительных  процессов  [23].  АК  сама  по  себе  может  легко  восстанавливать  многие  другие  антиоксиданты  в  организме  или  напрямую  реагировать  с  активными  формами  кислорода,  обезвреживая  их  [21].  Из  сказанного  следует,  что  помимо  содержания  флавоноидных  соединений  ценность  растительного  сырья  определяет  и  количественный  показатель  АК. 

Положительные  эффекты  растительных  БАВ  обуславливают  поиск  новых  и  применение  хорошо  изученных  растений  для  производства  лечебных  и  профилактических  средств.  В  данной  работе  исследуется  малоизученное  травянистое  растение  шизонепета  многонадрезанная  (Schizonepeta  multifida)  семейства  яснотковые  (Lamiaceae),  произрастающее  по  всей  Сибири,  на  Дальнем  Востоке,  в  Монголии  и  Китае.  В  первую  очередь,  в  научных  работах  шизонепета  фигурирует  как  эфиронос,  хотя  есть  упоминания  о  наличии  в  нём  достаточно  высокого  содержания  флавоноидов  [8].  Последнее  послужило  поводом  к  его  изучению  с  целью  обосновать  возможность  его  применения  как  ценного  источника  антиоксидантов.

Материал  и  методы.  Растительное  сырье  (надземная  часть  —  трава)  было  заготовлено  в  период  цветения  растений  в  экологически  чистых  районах  республики  Хакасия.  Следует  заметить,  что  фаза  цветения  соответствует  наибольшему  накоплению  фенольных  соединений  и  содержанию  АК,  близкому  к  максимальному  [9].  Свежесобранный  материал  сушился  до  воздушно-сухого  состояния  и  непосредственно  перед  анализом  гомогенизировался  до  размера  частиц  1—2  мм.

Сначала  были  проведены  качественные  капельные  и  пробирочные  реакции  на  основные  группы  флавоноидных  соединений.  Для  этого  после  извлечения  70  %  этанолом  в  аппарате  Сокслета  экстракт  упаривался  под  вакуумом  и  обрабатывался  хлороформом  для  удаления  липофильной  фракции  (хлорофилл,  эфирные  масла  и  др.).  Гидрофильный  осадок  растворялся  в  исходном  растворителе  для  проведения  следующих  реакций:  цианидиновая  проба,  взаимодействие  со  щелочами,  борно-лимонная  реакция,  проба  Запрометова,  обработка  уксуснокислым  свинцом,  реакция  с  трёххлористой  сурьмой  в  четырёххлористом  углероде  [17],  образование  окрашенных  комплексов  с  хлоридом  железа  (III)  [10]  и  алюминия;  реакции  диазотирования,  с  молибдатом  натрия,  с  пикриновой  кислотой,  с  раствором  железоаммониевых  квасцов;  восстановление  серебра  из  аммиачного  раствора,  госсипетиновая  проба,  взаимодействие  с  10  %  щавелевой  кислотой  в  50  %  водном  ацетоне,  реакция  с  5  %  спиртовым  раствором  паратолуолсульфокислоты,  а  также  просмотр  в  УФ-свете  [5,  20]. 

Далее  осуществлялся  спектрофотометрический  количественный  анализ  основных  групп  действующих  веществ;  измерения  проводились  на  приборе  Unico  2800.  Следует  отметить,  что  спектрофотометрия  комплексов  флавоноидов  с  Al³⁺  считается  наиболее  эффективным  методом  их  количественной  оценки  [13]. 

Из  веществ  флавоноидной  природы  определялись  лютеолин  и  апигенин,  которые  согласно  литературным  данным  [8]  присутствуют  в  S.  multifida  в  наиболее  значимых  количествах.  Также  определялся  кверцетин  как  наиболее  изученный  их  представитель,  обладающий  ярко  выраженной  Р-витаминной  активностью  и  отражающий  содержание  витамина  Р  (рутина)  как  такового  (рутин  —  гликозид  кверцетина).  Помимо  флавоноидов  определялось  содержание  аскорбиновой  кислоты  и  оценивалась  интегральная  антиокислительная  активность. 

Для  количественного  анализа  лютеолина  и  апигенина  использовали  извлечение  70  %  этиловым  спиртом  при  соотношении  сырья  и  экстрагента  1  к  30  (данное  соотношение  даёт  максимальный  выход  флавоноидов  из  растительного  сырья  [1])  в  аппарате  Сокслета  в  течение  3  ч.  Выбор  экстрагента  обусловлен  тем  обстоятельством,  что  70  %  этанол  обеспечивает  наиболее  полное  извлечение  как  гликозидов,  так  и  агликонов  флавоноидов  [6,  16]. 

В  соответствии  с  методикой  определения  лютеолина  [1]  потребовалось  разведение  полученного  экстракта  70  %  этанолом  в  3,33  раза.  Для  спектрофотометрирования  берётся  смесь  разведённого  экстракта,  2%  раствора  алюминия  хлорида  в  95  %  этаноле  и  95  %  этанола  в  соотношении  2:1:22.  В  качестве  раствора  сравнения  используются  те  же  компоненты,  но  с  заменой  соли  на  водно-спиртовой  раствор  HCl.  Обнуление  по  раствору  сравнения  и  измерение  оптической  плотности  опытного  раствора  осуществляется  при  λ=400  нм  (максимум  поглощения  при  данной  длине  волны  отмечен  для  комплекса  государственного  стандартного  образца  лютеолин-7-гликозида  с  AlCl₃)  по  истечении  20  мин  после  их  приготовления.  Содержание  суммы  флавоноидов  в  пересчёте  на  лютеолин-7-гликозид  и  абсолютно  сухое  сырьё  в  процентах  вычисляется  по  предложенной  нами  унифицированной  формуле:

Х=D×V×k/m×E

где:  D  —  оптическая  плотность  испытуемого  раствора; 

V  —  объём  экстракта; 

k  —  коэффициент,  отражающий  суммарное  разбавление  экстракта  вплоть  до  измерения  оптической  плотности; 

m  —  масса  навески  сухого  сырья  в  граммах; 

E  —  удельный  показатель  поглощения  комплекса  лютеолин-7-гликозида  с  алюминия  хлоридом  при  длине  волны  400  нм,  равный  145.

Для  количественного  анализа  апигенина  экстракт,  также  разведённый  этанолом  в  3,33  раза,  дополнительно  разводился  экстрагентом  в  12,5  раза.  Прямая  спектрофотометрия  осуществлялась  при  при  λ=269  нм,  что  совпадает  с  одним  из  максимумов  поглощения  апигенина  [2].  Обнуление  проводится  по  растворителю  —  70  %  этанолу.  Расчёт  ведётся  по  формуле,  указанной  выше  (с  учётом  удельного  показателя  для  апигенина).

Содержание  кверцетина  находилось  суммарное  [13],  т.  е.  как  свободного,  так  и  в  составе  гликозида  (рутина).  Для  этого  экстракция  аналогичным  образом  осуществлялась  90  %  этанолом,  содержащим  1  %  соляной  кислоты,  необходимой  для  гидролиза  рутина  до  кверцетина  и  дисахарида  рутинозы.  Оптическая  плотность  измеряется  при  λ=430  нм  после  добавления  к  аликвоте  2  мл  гидролизата  1  мл  1  %  раствора  AlCl₃  в  95  %  этиловом  спирте.  При  обнулении  спиртовой  раствор  соли  заменяется  на  95  %  этанол.  Для  расчёта  также  предлагается  аналогичная  формула  с  E=764,6.

Количество  аскорбиновой  кислоты  определялось  методом  прямой  спектрофотометрии  по  Hewitt  E.J.  и  Dickes  G.J.  [19].  Гомогенизация  навески  измельчённого  растительного  материала  (≈1  г)  осуществлялась  в  10  мл  2  %  водной  метафосфорной  кислоты,  которая  стабилизирует  аскорбат  в  растворе.  В  полученный  гомогенат  вносилась  смесь  растворов  метафосфорной  кислоты  и  среднего  фосфата  натрия  (отношение  3:2,  рН=7,35)  в  количестве  40  мл.  Далее  экстракт  центрифугируется  при  3000  об/мин  в  течение  15  мин.  Экстинкция  супернатанта  фиксируется  при  λ=265  нм  против  стандарта  —  смеси  растворов  метафосфорной  кислоты  и  среднего  фосфата  натрия  в  указанном  соотношении.  Результаты  в  пересчёте  на  абсолютно  сухое  сырьё  в  процентах  вычисляются  по  преобразованной  нами  авторской  формуле:

Х=D×50×176×100/m×ε₂₆₅×1000

где:  D  —  оптическая  плотность  испытуемого  раствора; 

50  —  объём  экстракта,  мл; 

100  —  коэффициент  перевода  в  проценты; 

176  —  молярная  масса  АК; 

m  —  масса  навески  сухого  сырья  в  граммах; 

1000  —  коэффициент  перевода  концентрации  в  экстракте  в  концентрацию  в  сухой  растительной  массе; 

ε₂₆₅  —  коэффициент  молярной  экстинкции  для  АК,  равный  1,655×10⁴.

Аскорбиновая  кислота  при  этом  определяется  как  сумма  взаимопревращающихся  восстановленной  и  окисленной  форм.

На  заключительном  этапе  была  проведена  оценка  интегральной  антиоксидантной  активности  [12],  для  чего  готовился  водный  экстракт  S.  multifida  путём  нагревания  1,5  г  сухого  измельчённого  сырья  со  100  мл  воды  на  водяной  бане  с  обратным  холодильником  в  течение  20  мин.  В  основе  методики  лежит  способность  антиоксилительных  веществ  in  vitro  ингибировать  процесс  аутоокисления  адреналина  в  щелочной  среде  [14].  Скорость  данного  процесса  фиксируется  по  накоплению  первичного  продукта  окисления  адреналина  в  среде  инкубации  при  λ=347  нм.  Для  этого  к  3  мл  0,2  М  натрий-карбонатного  буфера  (рН=10,65)  добавляется  0,045  мл  полученного  экстракта  и  0,15  мл  0,1  %  аптечного  адреналина  гидрохлорида,  перемешивается  и  измеряется  абсорбция  при  указанной  длине  волны  через  каждые  30  (15)  сек  в  течение  10  мин.  В  контрольную  пробу  (для  обнуления)  адреналин  не  вносится.  Холостая  проба  не  содержит  фитоэктракт  и  в  ней,  таким  образом,  наблюдается  максимальное  нарастание  оптической  плотности  (ингибитор  отсутствует).  Антиоксидантная  активность  (АА)  фитоэкстракта  выражается  в  процентах  ингибирования  по  формуле:

АА=(D₁–D₂)×100/  D₁

где:  D₁  и  D₂  —  скорости  возрастания  оптической  плотности  в  холостой  и  опытной  пробе  соответственно.

Результаты.  Качественный  анализ  Schizonepeta  multifida  показал,  что  в  данном  растении  присутствуют  такие  группы  фенольных  соединений  как  флавоны,  флавонолы,  ауроны,  а  также  ортодиоксигруппировки  флавоноидов. 

Гораздо  больший  интерес  представляют  результаты  количественного  анализа,  представленные  ниже  (таблица).

Таблица  1.

Содержание  флавоноидов  и  аскорбиновой  кислоты  в  надземной  части  S.  multifida  в  пересчёте  на  абсолютно  сухую  массу

При  исследовании  суммарной  антиоксидантной  активности  наблюдался  прооксидантный  эффект:  введение  экстракта  в  щелочной  буфер  с  адреналином  ускоряло  окисление  последнего. 

Обсуждение  полученных  результатов.  Из  данных  таблицы  видно,  что  лютеолин  и  апигенин  в  S.  multifida  представлены  в  достаточно  большом  количестве,  значимом  для  позитивного  биологического  эффекта  при  использовании  данного  растения  в  качестве  пищевого  сырья  или  возможного  лекарственного  препарата.  Содержание  же  кверцетина  несущественно.

  Количество  АК  оказалось  низким,  что,  возможно,  частично  обусловлено  её  потерями  в  процессе  сушки  собранной  травы:  аскорбат  окисляется  при  большом  доступе  воздуха  (кислорода)  [4].  Однако,  даже  учитывая  эти  потери,  полученная  цифра  позволяет  говорить:  данное  растение  обеднено  витамином  С.  Всё  же,  более  объективная  оценка  содержания  аскорбата  в  S.  multifida  требует  анализа  свежесобранной  сырой  массы.

Наблюдаемый  прооксидантный  эффект  при  определении  интегральной  антиоксидантной  ценности  теоретически  возможен  в  случае  достаточно  большого  содержания  антиоксидантов  в  растворе  [18].  Это  коррелирует  с  высокой  концентрацией  флавоноидов-антиоксидантов:  лютеолина  и  апигенина.  Нельзя  отрицать  и  возможности  наличия  весомого  количества  других  флавоноидов,  не  упоминавшихся  в  литературе,  но  вносимых  существенный  вклад  в  биологическую  ценность,  в  т.  ч.  антиокислительную.  Здесь  требуются  дополнительные  исследования  спектров  фитоэкстракта  и  данных  хроматографического  анализа.

Суммируя  вышесказанное,  можно  сделать  следующие  выводы:

1.В  ходе  проведённого  анализа  установлено,  что  надземная  часть  Schizonepeta  multifida  содержит  вещества  флавоноидной  природы,  относящиеся  к  разным  классам.

2.На  основании  анализа  трёх  методик  предложена  унифицированная  формула  для  спектрофотометрического  определения  флавоноидов  в  сухом  растительном  материале,  которая  позволяет  рассчитать  процентное  содержание,  используя  удельный  показатель  поглощения  данного  соединения  или  его  окрашенного  комплекса.  В  определении  аскорбата  по  Hewitt  E.J.  и  Dickes  G.J.  авторская  формула  также  была  нами  существенно  модифицирована,  давая  возможность  напрямую  рассчитывать  количество  АК  в  процентах.

3.Количественное  содержание  лютеолина  и  апигенина  достаточно  высокое,  чтобы  говорить  о  позитивном  биологическом  эффекте.  Однако  количество  такого  важного  антиоксиданта,  как  аскорбиновая  кислота,  несущественно.

4.Установленная  высокая  интегральная  антиоксидантная  активность  экстракта  S.  multifida  позволяет  предположить,  что  данное  растение  помимо  значимого  содержания  указанных  выше  веществ  несёт  в  себе  существенные  количества  других  индивидуальных  антиокислительных  компонентов.

5.Полученные  результаты  можно  рекомендовать  для  дальнейших  химических  и  фармакологических  испытаний.

Список  литературы:

1. Андреева  В.Ю.  Разработка  методики  количественного  определения  флавоноидов  в  манжетке  обыкновенной  Alchemilla  vulgaris  /  В.Ю.  Андреева,  Г.И.  Калинкина  //  Химия  растительного  сырья.  —  2000.  —  №  1.  —  С.  85—88.
2. Афанасьева  Ю.Г.  Фармакогностические  исследования  по  разработке  лекарственных  растительных  средств  с  противоаллергической  активностью:  автореф.  дис.  д-ра  фармацевт.  наук:  14.04.02  /  Ю.Г.  Афанасьева.  —  Пермь,  2013  —  44  с.
3. Бандюкова  В.А.  Антибактериальная  активность  флавоноидов  некоторых  видов  цветковых  растений  /  В.А.  Бандюкова  //  Растительные  ресурсы.  —  1987.  —  Т.  23,  Вып.  4.  —  С.  607—611.
4. Березовский  В.М.  Химия  витаминов  —  2-е  изд.,  перераб.  и  доп.  —  М.:  «Пищевая  промышленность»,  1973.  —  632  с.
5. Биологически  активные  вещества  растений:  выделение,  разделение,  анализ  /  Г.Д.  Бердимуратова  [и  др.].  —  Алматы:  Изд-во  КазНУ,  2006.  —  438  с.
6. Волкова  А.А.  Исследование  одно-  и  двулетних  побегов  вишни  обыкновенной  в  качестве  источника  полифенольных  соединений  в  условиях  экосистемы  человека  /  А.А.  Волкова  //  Экология  человека.  —  2007.  —  №  7.  —  С.  8—11.
7. Гольдберг  Е.Д.  Препараты  растений  в  комплексной  терапии  злокачественных  новообразований  /  Е.Д.  Гольберг,  Е.П.  Зуева.  —  Томск:  Изд-во  Томского  ун-та,  2000.  —  129  с.
8. Дудченко  Л.  Г.  Пряно-ароматические  и  пряно-вкусовые  растения  /  Л.Г.  Дудченко,  А.С.  Козьяков,  В.В.  Кривенко  —  К.:  Наукова  думка,  1989.  —  304  с.
9. Ильина  Л.П.  Сравнительное  изучение  химического  состава  лекарственных  растений  Зпадного  Забайкалья  /  Л.П.  Ильина,  Г.Б.  Ендонова,  Т.П.  Анцупова  //  Производство  и  переработка  сельскохозяйственной  продукции.  —  2011  —  №  3.  —  С.  75—80.
10. Лобанова  А.А.  Исследование  биологически  активных  флавоноидов  в  экстрактах  из  растительного  сырья  /  А.А.  Лобанова,  В.В.  Будаева,  Г.В.  Сакович  //  Химия  растительного  сырья.  —  2004  —  №  1.  —  С.  47—52.
11. Махлаюк  В.П.  Лекарственные  растения  в  народной  медицине  /  В.П.  Махлаюк.  —  М.:  Нива  России,  1992.  —  478  с.
12. Новый  подход  в  оценке  антиоксидантной  активности  растительного  сырья  при  исследовании  процесса  аутоокисления  адреналина  /  Е.И.  Рябинина  [и  др.]  //  Химия  растительного  сырья.  —  2011.  —  №  3.  —  С.  117—121.
13. Природные  флавоноиды  /  Д.Ю.  Корулькин  [и  др.]  ;  Рос.  акад.  наук,  Сиб.  отд.,  Новосиб.  ин-т  органической  химии.  —  Новосибирск:  Академическое  изд-во  «Гео»,  2007.  —  232  с.
14. Сирота  Т.В.  Новый  подход  в  исследовании  процесса  аутоокисления  адреналина  и  использование  его  для  измерения  активности  супероксиддисмутазы  /  Т.В.  Сирота  //  Вопр.  мед.  химии.  —  1999.  —  Т.  45,  Вып.  3.  —  С.  263—272.
15. Снисаренко  Т.А.  Физиологические  и  биохимические  аспекты  адаптации  видов  рода  Dianthus  L.  флоры  Предкавказья  /  Т.А.  Снисаренко,  Ю.Р.  Мутыгуллина  //  Вестник  ЧГПУ.  —  2009.  —  №  1.  —  306—313  с.
16. Флавоноиды  травы  эхинацеи  пурпуной  /  В.А.  Куркин  [и  др.]  //  Химия  растительного  сырья.  —  2010.  —  №  4  —  С.  87—89.
17. Химический  анализ  лекарственных  растений:  учебное  пособие  для  фармацевтических  вузов  /  Е.Я.  Ладыгина,  Л.Н.  Сафрович,  В.Э.  Отряшенкова  [и  др.]  ;  под.  ред.  Н.И.  Гринкевич,  Л.Н.  Сафрович.  —  М.:  Высш.  школа,  1993  —  176  с.
18. Gutteridge  V.  Oxygen  damage  in  biological  systems.  Free  radical,  Aging  and  Degenerative  Disease  /  V.  Gutteridge,  T.  Westermarck,  B.  Halliwell  —  New  York:  Ed.  By  Yohson  Y.,  1986  —  235  p.
19. Hewitt  E.J.  Spectrophotometric  measurements  on  аscorbic  acid  and  their  use  for  the  estimation  of  ascorbic  acid  and  dehydroascorbic  acid  in  plant  tissuer  /  E.J.  Hewitt,  G.J.  Dickes  //  Biochem.  J.  —  1961.  —  Vol.  78,  №  2.  —  Р.  384—391.
20. Markham  K.R.  Techniques  of  flavonoid  identification  /  K.R.  Markham.  —  London:  Acad.  Press,  1982.  —  113  p.
21. Olajire  A.  Total  antioxidant  activity,  phenolic,  flavonoid  and  ascorbic  acid  contents  of  Nigerian  vegetables  /  A.  Olajire,  L.  Azeez  //  African  Journal  of  Food  Science  and  Technology.  —  2011.  —  Vol.  2,  №  2.      P.  22—29.
22. Phenol  Antioxidant  Quantity  and  Quality  in  Foods  /  J.A.  Vinson  [et  al.]  //  J.  Agric.  Food  Chem.  —  1998.  —  Vol.  46,  №  9.  —  Р.  3630—3634.
23. Quercetin  protects  cutaneous  tissue-associated  cell  types  including  sensory  neurons  from  oxidative  stress  induced  by  gluthatione  depletion  cooperative  effects  of  ascorbic  acid  /  S.D.  Skaper  [et  al.]  //  Free  Radical  Biology  and  Medicine.  —  1997.  —  Vol.  22,  №  4.  —  P.  669—678.
24. Rice-Evans  C.A.  Antioxidant  properties  of  fenolic  compounds  /  C.A.  Rice-Evans,  N.J.  Miller,  G.  Paganga  /  Trends  in  plant  science.  —  1997.  —  Vol.  2,  №  4.  —  P.  152—159.