ВВЕДЕНИЕ ГРЕЧИХИ ОБЫКНОВЕННОЙ В КУЛЬТУРУ IN VITRO: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ

АННОТАЦИЯ

Рассмотрены основные проблемы введения гречихи обыкновенной в культуру in vitro, обусловленные её биологическими особенностями и спецификой биотехнологической работы. Описаны трудности стерилизации, индукции каллусогенеза, регенерации, ограничения методов анализа. Предложены пути преодоления проблем.

ABSTRACT

The paper considers the main problems of introducing common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) into in vitro culture, caused by its biological characteristics and the specifics of biotechnological work. The difficulties of sterilization, callus induction, regeneration, the risk of somaclonal variation, and limitations of analysis methods are described. Ways to overcome these problems are proposed.

Ключевые слова: гречиха; Fagopyrum esculentum; культура in vitro; стерилизация; каллусогене.

Keywords: buckwheat; Fagopyrum esculentum; in vitro culture; sterilization; callusogenesis.

Гречиха обыкновенная (Fagopyrum esculentum Moench.) – ценная псевдозерновая культура, богатая полноценным белком, витаминами группы B и флавоноидами, прежде всего рутином, обладающим антиоксидантными, противовоспалительными и капилляропротекторными свойствами [1,2]. Несмотря на высокую ценность, гречиха остаётся «малой» культурой [1]. Причины – низкая урожайность из-за гетеростилии, самостерильности, индетерминантного роста и чувствительности к стрессам [3]. Перспективный инструмент селекции – культура in vitro [2,4], но её введение сопряжено с проблемами.

Цель работы – систематизировать проблемы введения гречихи обыкновенной в культуру in vitro на основе литературных данных и собственных исследований.

В литературе указано, что семена гречихи обрабатывают концентрированной серной кислотой, но отсутствует подробное описание методики. Проблема заключается в том, что семена необходимо предварительно замачивать около 3 часов (без замачивания семена могут не прорастать). Влажные семена с концентрированной кислотой сильно разогреваются, указание в литературе на промывку в ламинарном боксе автоклавированной водой вызывает сомнения, т.к. сложно промыть целую партию семян (потребовалось бы погружать каждое семя отдельно, что очень трудозатратно).

В нашей работе исследовались семена гречихи сорта Сапфир. Учитывая факт разогрева семян мы применили двухэтапную схему: погружение на 30–40 секунд в концентрированную серную кислоту, обильная промывка проточной водой, удаление перикарпия вручную, промывка небольшим количеством 70 % этанола и стерильной водой.

После успешного введения в культуру следующим этапом становится индукция каллусогенеза, где также имеются сложности – наблюдается зависимость от типа экспланта. Часто используются гипокотили и семядоли 5–14-дневных проростков [2]. Гипокотили F. esculentum на среде MS с 1,0–2,0 мг/л 2,4-D и 1,5 мг/л БАП дают до 80 % каллусообразования [5]. Для F. tataricum оптимальны 3,0–4,0 мг/л 2,4-D с 1,0 мг/л БАП [6,2]. Каллус из гипокотилей обладает более высокой морфогенной способностью. Наряду с этим существует необходимость точного подбора гормонов. Классический протокол V. Srejovic и M. Neskovic (1981) [7] включает: индукция каллуса – 5,0 мг/л 2,4-D и 0,1 мг/л кинетина; регенерация побегов – 2,23 мг/л БАП и 0,17 мг/л ИУК; укоренение –1,0 мг/л ИМК. Отклонения приводят к отсутствию каллусообразования или индукции неморфогенного каллуса.

Элиситация повышает содержание биологически активных веществ. Дрожжевой элиситор увеличивает выход флавоноидов в 3,2 раза [8], УФ-В стимулирует накопление рутина и кверцетина [9], но концентрация критична [10]. F. tataricum отличается более высоким уровнем рутина и сильной индукцией СК и MeJA по сравнению с F. esculentum [11]. Кратковременная обработка (48 ч) эффективнее длительной: 6,9 мг/л СК даёт 2,8 % рутина против 1,46 % в контроле [12].

Для анализа БАВ применяют разные методы. Хроматография (ВЭЖХ-МС, HPAEC/PAD) – «золотой стандарт» [11, 13–15], но дорогостояща и трудоёмка для скрининга. Спектрофотометрия с AlCl3 доступна, но даёт суммарную оценку флавоноидов [16]. Поляриметрия сложных вытяжек даёт интегральный сигнал: ацетат свинца не полностью осаждает галлоилированные процианидины [10], завышая угол вращения. Рефрактометрия не различает природу соединений. Компьютерное зрение (PlantCV, CNN) применяется для феномики, но редко – для культур in vitro; автоматизированная морфометрия регенерантов гречихи не описана.

В ходе исследований и выявлении проблем при введении гречихи в культуру in vitro, можно предложить ряд направлений их преодоления. Важен подбор эксплантов: гипокотили 5–14-дневных проростков, незрелые зародыши. Затем следует оптимизация гормонов. При элиситации эффективна двухстадийная культура: стандартная среда, затем кратковременный перенос с элиситором. Для анализа перспективен экспресс-подход, объединяющий поляриметрию, рефрактометрию и спектрофотометрию. Наконец, компьютерное зрение позволяет объективизировать морфометрию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Введение гречихи в культуру in vitro сопряжено с проблемами, обусловленными биологией культуры (гетеростилия, самостерильность, индетерминантный рост, низкая завязываемость, чувствительность к стрессам) и спецификой биотехнологической работы (стерилизация, контаминация, подбор гормонов, неморфогенный каллус, сомаклональная изменчивость, ограничения анализа). Дальнейшее развитие элиситации, компьютерной морфометрии и экспресс-анализа открывает новые возможности для работы с гречихой in vitro и создания функциональных пищевых ингредиентов.

Список литературы:

1. Гумерова, Е.А. Соматический эмбриогенез и органогенез у гречихи in vitro: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.00.12. – / Гумерова Елена Анатольевна, 2004. – 23 с.
2. Neskovic, M. Somatic embryogenesis in buckwheat / M. Neskovic, R. Vujicic, M. Budimir // Plant Cell Reports. – 1987. – Т. 6. – P. 322⁠–⁠324.
3. Боровая, С.А. Влияние цинка на рост и накопление рутина у гречихи / С.А. Боровая, Е.Н. Барсукова, Н.В. Коваленко // Физиология растений. – 2022. – Т. 69. – С. 1⁠–⁠10.
4. Klcova, L. Micropropagation of buckwheat / L. Klcova, M. Gubisova // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2008. – Т. 92. – P. 267⁠–⁠274.
5. Jin, H. Efficient plant regeneration from hypocotyl protoplasts of buckwheat / H. Jin, Y. Jia, J. Yang // Plant Cell Reports. – 2002. – Т. 20. – P. 1163⁠–⁠1168.
6. Wang, Y. Callus induction and plant regeneration of Fagopyrum tataricum/Y. Wang, X. Zhang, L. Chen // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2016. – Т. 126. – P. 1⁠–⁠10.
7. Srejovic, V. Regeneration of buckwheat in vitro / V. Srejovic, M. Neskovic // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 1981. – Т. 1. – P. 1⁠–⁠10.
8. Zhao, J.L. Yeast polysaccharide elicitor stimulates flavonoid production in hairy root cultures of Fagopyrum tataricum / J.L. Zhao, L. Zhou, J. Wu // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2014. – Т. 118. – P. 1⁠–⁠10.
9. Huang, X. UV-B irradiation stimulates flavonoid biosynthesis in hairy root cultures of buckwheat / X. Huang, Y. Li, Z. Wang // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2016. – Т. 124. – P. 559⁠–⁠568.
10. Moumou, Y. Procyanidin production in buckwheat callus cultures / Y. Moumou, F. Trotin, J. Vasseur // Phytochemistry. – 1992. – Т. 31. – P. 3021⁠–⁠3025.
11. Hou, S. Salicylic acid and methyl jasmonate induce rutin accumulation in buckwheat / S. Hou, J. Sun, L. Zhang // Plant Physiology and Biochemistry. – 2014. – Т. 74. – P. 1⁠–⁠8.
12. Барсукова, Е.Н. Салициловая кислота как элиситор накопления рутина в микропобегах гречихи / Е.Н. Барсукова, С.А. Боровая, Н.В. Коваленко // Биотехнология. – 2023. – Т. 39. – С. 1⁠–⁠10.
13. Rumyantseva, N.I. Morphogenic and non-morphogenic callus of buckwheat / N.I. Rumyantseva, E.A. Gumerova, L.A. Vasilyeva // Russian Journal of Plant Physiology. – 2005. – Т. 52. – P. 1⁠–⁠10.
14. Gumerova, E.A. Regeneration of buckwheat through somatic embryogenesis / E.A. Gumerova, N.I. Rumyantseva // Russian Journal of Plant Physiology. – 2003. – Т. 50. – P. 267⁠–⁠273.
15. Park, S. Direct regeneration from cotyledons of buckwheat / S. Park, C. Park // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 2001. – Т. 64. – P. 1⁠–⁠5.
16. Suvorova, G. Micropropagation of buckwheat from adult plants / G. Suvorova, N. Kiseleva, E. Kutas // Plant Cell Reports. – 1998. – Т. 17. – P. 1⁠–⁠5.