ПРИМЕНЕНИЕ ЦЕНТРАЛЬНОГО КОМПОЗИЦИОННОГО ПЛАНА ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИЙ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ UVSX И UVSY В E. COLI

APPLICATION OF CENTRAL COMPOSITE DESIGN FOR OPTIMIZATION OF EXPRESSION CONDITIONS OF RECOMBINANT ENZYMES UVSX AND UVSY IN E. COLI

Bikucheva Vilena Romanovna

Master's Student, Institute of Biomedical Systems and Biotechnology, Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University,

Russia, St. Petersburg

АННОТАЦИЯ

Ферменты UvsX и UvsY являются важными компонентами для рекомбиназной полимеразной амплификации (РПА). Однако экспрессия рекомбинантных ферментов в Escherichia coli часто сталкивается с трудностями, такими как образование телец включения и низкий выход растворимого белка. Целью исследования являлась оптимизация условий экспрессии данных ферментов с использованием центрального композиционного плана (Central Composite Design, CCD) для максимизации выхода целевых белков. В качестве независимых переменных были выбраны концентрация индуктора ИПТГ (0,1-1,3 мМ), температура культивирования (9-37 °C) и время инкубации (4-36 ч). Откликом служило процентное содержание белка, определенное методом электрофореза в ПААГ. Проведено 17 экспериментов, включая три повторности в центральной точке. Статистическая обработка данных с применением дисперсионного анализа ANOVA в программе Design-Expert 13.0.5.0 выявила, что для UvsX наибольшее влияние на выход оказывали время культивирования и взаимодействие температуры с временем, а для UvsY – температура, время и их взаимодействие. Оптимальные условия для UvsX: концентрация ИПТГ 0,64 мМ, температура культивирования 33 °C, время культивирования 5,5 ч; для UvsY: концентрация ИПТГ 0,53 мМ, температура культивирования 26 °C, время культивирования 5,5 ч. В результате было выделено и очищено 14 мг UvsX и 19 мг UvsY с одного литра культуральной жидкости. Разработанные модели могут быть использованы для промышленного получения рекомбинантных белков с заданными свойствами.

ABSTRACT

Enzymes UvsX and UvsY are important components for recombinase polymerase amplification (RPA). However, the expression of recombinant enzymes in Escherichia coli often encounters difficulties, such as the formation of inclusion bodies and low yields of soluble protein. The aim of this study was to optimize the expression conditions for these enzymes using a central composite design (CCD) to maximize the yield of the target proteins. The independent variables selected were the concentration of the inducer IPTG (0.1-1.3 mM), cultivation temperature (9-37 °C), and incubation time (4-36 h). The response was the percentage of protein determined by SDS-PAGE. A total of 17 experiments were performed, including three replicates at the center point. Statistical analysis of the data using ANOVA in Design-Expert 13.0.5.0 revealed that for UvsX, the most significant effects on yield were cultivation time and the interaction between temperature and time, while for UvsY, temperature, time, and their interaction had the greatest impact. The optimal conditions for UvsX were: IPTG concentration of 0.64 mM, cultivation temperature of 33 °C, and cultivation time of 5.5 h; for UvsY: IPTG concentration of 0.53 mM, cultivation temperature of 26 °C, and cultivation time of 5.5 h. As a result, 14 mg of UvsX and 19 mg of UvsY were isolated and purified per liter of culture medium. The developed models can be used for the industrial production of recombinant proteins with desired properties.

Ключевые слова: центральный композиционный план, Escherichia coli, оптимизация экспрессии, рекомбинантные белки, UvsX, UvsY, Design of Experiment (DoE), дисперсионный анализ ANOVA

Keywords: Central Composite Design, Escherichia coli, expression optimization, recombinant proteins, UvsX, UvsY, Design of Experiment (DoE), ANOVA analysis.

Введение

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) относится к наиболее чувствительным методам для диагностики инфекционных заболеваний. Одним из перспективных направлений исследований в области ПЦР-диагностики принято считать разработку тест-систем на основе изотермической амплификации, которые позволяют быстро проводить реакцию без необходимости применения сложного дорогостоящего оборудования. Особый интерес вызывает развитие методов рекомбиназной полимеразной амплификации (РПА), отличающейся высокой чувствительностью, специфичностью, скоростью реакции и устойчивостью к загрязнителям пробы [4 с. 540; 8, с. 131-132]. К ключевым ферментам для РПА относят рекомбиназы UvsX и UvsY бактериофага Т4, осуществляющих гибридизацию праймеров на комплементарных участках ДНК [1, с. 271]. Однако в Российской Федерации данные ферменты изучены недостаточно, что сильно ограничивает разработку тест-систем для ранней диагностики инфекционных заболеваний на основе РПА.

В настоящее время экспрессия рекомбинантных белков в E. coli сталкивается с рядом трудностей, включая структурные особенности и размер полипептида, нестабильность мРНК, затруднения фолдинга, деградацию протеазами, а также возможную токсичность продукта для клетки-продуцента. [6, с. 51; 7, с. 56;] Вследствие этого при экспрессии белков часто формируются нефункциональные продукты и/или тельца включения. Это может быть обусловлено как неэффективностью клеточных шаперонов, так и накоплением большого числа промежуточных форм сворачивания. Получение белков рефолдингом из телец включения характеризуется низким выходом и длительностью процедур, поэтому предпочтение отдаётся получению растворимого белка, так как экспрессия в растворимой форме дешевле, быстрее и значительно упрощает процесс выделения и очистки. [6, с. 51]. Более того, экспрессионные штаммы E. coli отличаются по ряду характеристик, которые в том числе оказывают влияние на выход целевого белка. Так, например, штамм E coli BL21 считается наиболее предпочтительным для промышленного производства рекомбинантных белков. Данный штамм характеризуется дефицитом протеаз Lon и OmpT, что обеспечивает гидролиз чужеродных белков и расщепление внеклеточных белков. Однако, на эффективность экспрессии влияет не только выбор экспрессионного штамма E coli, но и условия индукции. [7, с. 56] Таким образом, подбор экспрессионного штамма в сочетании с оптимизацией условий экспрессии остается наиболее рациональной стратегией.

Традиционные подходы к оптимизации условий экспрессии основаны на методах однофакторного анализа (One Variable At a Time, OVAT). Однако такие методы не учитывают взаимодействия между параметрами, что приводит к неэффективной оптимизации и избыточному числу экспериментов [1, с. 177; 13, с. 2]. В современных исследованиях однофакторный анализ уступает место методам планирования эксперимента (Design of Experiments, DoE), которые позволяют одновременно оценивать взаимосвязь нескольких параметров и их влияние на конечный результат [1, с 177; 12, с. 2.]. Таким образом, методы планирования эксперимента обеспечивают точный подбор условий для максимально эффективной экспрессии рекомбинантных белков.

К основным методам планирования эксперимента DoE относят полный факторный план (Full Factorial Design), дробный факторный план (Fractional Factorial Design), план Плакета-Бермана (Plackett-Burman), а также метод поверхностного отклика (Response Surface Methodology, RSM). Последний широко применяется в биотехнологии для оптимизации условий экспрессии рекомбинантных белков. Данный метод представляет собой комплекс математических и статистических подходов, предназначенных для моделирования, анализа и оптимизации сложных многофакторных процессов. Цель метода – поиск оптимального сочетания входных параметров, обеспечивающего максимальный выход целевого продукта [1, с. 177; 10, с. 106; 13, с. 2]. В рамках метода поверхностного отклика применяют план Бокса-Бенкена (Box-Behnken Design, BBD) и центральный композиционный план (Central Composite Design, CCD) [12 с. 2; 13, с. 2].

Центральный композиционный план представляет собой классическую модель планирования эксперимента. Данный план находит применение не только в биотехнологии, но в широком спектре научных и прикладных дисциплин, включая фармацевтику, химическую технологию, пищевую промышленность и другие. Это связано с тем, что он представляет собой универсальную и легко применимую матрицу планирования, позволяющую эффективно оценивать линейные и квадратичные эффекты факторов, их взаимодействия, а также моделировать нелинейные зависимости отклика при минимальном количестве экспериментов. [9, с. 2]. При применении центрального композиционного плана факторы изучаются на пяти уровнях (- α, - 1, 0, + 1, + α), тогда как применение плана Бокса-Бенкена позволяет рассматривать факторы лишь на трех уровнях (- 1; 0; + 1). Это делает центральный композиционный план более точным, поскольку звездные точки (± α) обеспечивают дополнительную информацию о поведении системы за пределами факторного пространства. [11, с. 538 ; 14, с. 523-524]

Структура центрального композиционного плана включает полный факторный эксперимент с количеством точек равном N₀ = 2ⁿ, где n – количество факторов, дополненный n₀ центральной (x_i = 0; i = 1, 2, 3, …, n) и «звездными» точками (x_i = ±α; i = 1, …, n; x_j = 0; j = 1, …, n; I = j; где α – это плечо «звездной» точки). Для «звездных» точек один фактор i устанавливается на крайнем уровне (±α), а остальные факторы j – на центральных уровнях. [5, с. 156-157; 9, с. 2] Полный факторный эксперимент позволяет изучать линейные эффекты и взаимодействия между факторами, центральные точки оценивают вариативность и стабильность процесса, а «звездные» точки – нелинейные эффекты. Значение плеча «звездных» точек α определяется по формуле [5, с. 156-157]:

Где N₀ = 2ⁿ – число опытов полного факторного эксперимента;

N – число всех опытов центрального композиционного плана.

Для каждого фактора X_i центр плана X_i⁰ определяется выражением [5, с. 156-157]:

Где  – максимальное значение фактора в физической величине;

 – минимальное значение фактора в физической величине.

Обычно применяют дополнительный дисперсионный анализ ANOVA, который определяет коррелирующие факторы. Адекватность модели определяют по критерию Фишера F и коэффициенту детерминации R². [15, с. 61-62]

Материалы и методы

Материалы.

Нуклеотидные последовательности белков UvsX и UvsY были получены на основе базы данных UniProt: P04529 и P04537 соответственно. Для генетической конструкции использовали вектор pETDuet (Novagen, США). В качестве экспрессионного штамма использовали E. coli BL21(DE3) (Novagen, США).

Сборка плазмиды.

Гены UvsX и UvsY оптимизировали по кодонным предпочтениям для экспрессии в E. coli с помощью web ресурса TISIGNER и синтезировали de novo из олигонуклеотидов (Евроген, Россия) с помощью перекрывающейся ПЦР. Отсутствие точечных мутаций в генетической конструкции проверяли секвенированием по Сэнгеру. Полученные гены клонировали в плазмидный вектор pETDuet по сайтам рестрикции BamHI и XhoI с сохранением гексагистидиновой метки на N-конце, затем трансформировали клетки E. coli BL21(DE3).

Оптимизация условий экспрессии.

Для оптимизации условий экспрессии генов полученных рекомбинантов применяли центральный композиционный план (Central Composite Design, CCD). В качестве независимых переменных параметров были выбраны: концентрация индуктора ИПТГ (0,1 мМ; 1,3 мМ), температура (плюс 9 ºC; плюс 37 ºC), и время инкубации (4 ч; 36 ч). В качестве зависимой переменной (отклика) выступало процентное содержание белка. При проектировании матрицы эксперимента в программе Design-Expert 13.0.5.0. [12, с. 137-138] со стандартным набором из 3 закодированных переменных составили 17 экспериментов. Полный факторный эксперимент составил 8 экспериментов. Количество звездных точек – 6. Центральная точка оценивалась в трех повторностях. Данная матрица представлена в Табл. 1.

Таблица 1.

Матрица эксперимента по подбору условий экспрессии белка

Подготовка посевного материала.

На одну колбу подготавливали 200 мл питательной среды LB-24 с добавлением антибиотиков. В качестве посевного материала добавляли

1 % ночной культуры. Устанавливали колбы в шейкер-инкубатор (Thermo Fisher Scientific, США) и культивировали до тех пор, пока оптическая плотность не достигала 0,5-0,6 при длине волны 600 нм. Далее в промаркированные стерильные фальконы объемом 50 мл переносили полученную культуральную жидкость по 10 мл, вносили индуктор ИПТГ (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствующей концентрации и культивировали при соответствующих условиях.

Количественное определение содержания белка в биомассе.

Определение содержание белков UvsX и UvsY проводили электрофорезом в 12 % полиакриламидном геле (ПААГ) при 200 В в течение 40 мин. Гель окрашивали 60 мин путем добавления к гелю красителя Кумасси (Bio-Rad, США), отмывку проводили дистиллированной водой и обесцвечивающим раствором (этанол 96 %, уксусная кислота, дистиллированная вода). Процентное содержание белка рассчитывали по снимкам электрофореза в программе Image Lab 6.1.

Статистическая обработка данных.

Статистическую обработку данных выполняли в программе Design-Expert 13.0.5.0. Для интерпретации результатов применяли дисперсионный анализ ANOVA. Адекватность полученной модели оценивали по критерию Фишера F и коэффициенту детерминации R². Коррелирующие факторы определяли по уровню значимости (p-критерию).

Результаты и обсуждения

В результате электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в некоторых образцах наблюдалась более яркая полоса целевого белка в контрольной пробе без индукции. Это может указывать на базальную экспрессию плазмидной конструкции. Процентное содержание целевого белка в каждой пробе, соответствующей условиям экспрессии из Табл. 1 представлено в Табл. 2.

Таблица 2.

Процентное содержание целевого белка

Для выборки данных отклика, т. е. процентного содержание белка UvsX, провели дисперсионный анализ ANOVA на основе модели отклика Quadratic (квадратичная модель), которая учитывает линейные эффекты каждого фактора, взаимодействия между парами факторов, а также квадратичные эффекты. По данным дисперсионного анализа ANOVA (Табл. 3) для модели, построенной по центральному композиционному плану, установили, что модель являлась статистически значимой в целом. Значимость уравнения регрессии проверяли с помощью критерия Фишера (F-критерия). Рассчитанное значение для построенной модели составило 5,49, что подтверждает статистическую значимость.  Более того, значение уровня значимости (p-критерия) составило 0,0176 и оказалось меньше критической точки (p < 0,05). Коэффициент детерминации R² = 0,8759 указывало на то, что модель объясняла 87,59% вариаций отклика. Отдельно стоит отметить, что для критерия неадекватности значения составили F = 1,48 и p = 0,4506, что свидетельствует об адекватности модели для описания экспериментальных данных.

Таблица 3.

Дисперсионный анализ ANOVA для белка UvsX

Влияние факторов на исследуемые отклики считали статистически значимыми также при p < 0,05. В данном случае наиболее значимым фактором, влияющим на выход белка UvsX, являлось время культивирования (C: F = 10,67; p = 0,0137), тогда как температура культивирования и концентрация индуктора ИПТГ оказывали влияние меньше. При рассмотрении совокупного влияния нескольких факторов выяснили, что именно взаимодействие температуры и времени культивирования (BC: F = 22,33; p = 0,0021) оказывает наибольшее влияние на выход белка UvsX. Кроме того, статистически значимым оказались квадратичные эффекты факторов концентрация индуктора ИПТГ (А²: F = 10,88; p = 0,0131) и время культивации (C²: F = 5,65; p = 0,0491). Это свидетельствовало о том, что изменение отклика не пропорционально изменению данных факторов, а зависимость отклика от данных факторов имело параболический характер.

Решение, прогнозируемое программой Design-Expert 13.0.5.0, предполагает, что для достижения максимального выхода белка UvsX оптимальным временем культивирования биомассы после внесения индуктора ИПТГ в оптимальной концентрации 0,64 мМ является 5,5 ч при оптимальной температуре культивирования 33 ºС. (рис. 1). В таком случае прогнозируется выход белка UvsX в количестве 84 % от общего количества белка.

Рисунок 1. Графики с предлагаемым программой Design-Expert 13.0.5.0 решением по культивированию штамма-продуцента белка UvsX

Исследуемая выборка данных отклика, т. е. процентного содержание белка UvsY, также являлась корректной. В данном случае дисперсионный анализ ANOVA провели на основе модели отклика 2FI (двухфакторное взаимодействие), которая включала в себя линейные эффекты каждого фактора и взаимодействия между парами факторов. На основании дисперсионного анализа ANOVA (Табл. 4) выявили, что критерий Фишера F = 4,83, а уровень значимости p = 0,0145, что свидетельствует о статистической значимости модели в целом.  Коэффициент детерминации R² = 0,7433 указывает на то, что модель объясняет 74,33 % вариаций отклика. Более того для критерия неадекватности значения составили критерии составили F = 11,04 и p = 0,0857, что подтверждает адекватность модели для описания экспериментальных данных.

Таблица 4.

Дисперсионный анализ ANOVA для белка UvsY

В данном случае влияние факторов оценивали на статистическую значимость также при p < 0,05. Коррелирующими факторами оказались температура (B: F = 7,82; p = 0,0189) и время культивирования (C: F = 7,81; p = 0,0190), а их взаимодействие (BC: F = 13,30; p = 0,0045) оказывало наибольшее влияние на выход белка UvsY. Наименее значимым фактором оказалась концентрация индуктора ИПТГ, а также взаимодействие этого фактора со временем и температурой культивирования.

Предлагаемое программой Design-Expert 13.0.5.0 решение определило, что для достижения максимального выхода белка UvsY оптимальными значениями являются: время культивирования 5,5 ч после внесения индуктора ИПТГ в концентрации 0,53 мМ при температуре 26 ºC (рис. 2). В данном случае прогнозируется выход белка UvsY в количестве 96 % от общего количества белка.

Рисунок 2. Графики с предлагаемым программой Design-Expert 13.0.5.0 решением по культивированию штамма-продуцента белка UvsY

Выводы

Оптимизация условий экспрессий была произведена для экспрессионных штаммов-продуцентов E. coli BL21(DE3), содержащих рекомбинантные конструкции с генами белков UvsX и UvsY E. coli BL21(DE3) с применением центрального композиционного плана (Central Composite Design, CCD) и дополнительного дисперсионного анализа ANOVA в программе Design-Expert 13.0.5.0. В результате оптимизации было выявлено, что для достижения максимального выхода белка UvsX оптимальными значениями являются: время культивирования 5,5 ч после внесения индуктора ИПТГ в концентрации 0,64 мМ при температуре 33 ºC; для белка UvsY оптимальными значениями являются: время культивирования 5,5 ч после внесения индуктора ИПТГ в концентрации 0,53 мМ при температуре 26 ºC. С одного литра культуральной жидкости в зависимости от вышеуказанных условий культивирования было выделено и очищено 14 мг белка UvsX и 19 мг белка UvsY.

Список литературы:

1. Бондарева О.С., Батурин А.А., Миронова А.В. Рекомбиназная полимеразная амплификация: характеристика метода и применение в диагностике инфекционных заболеваний //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2024. – №. 2. – С. 270-280.
2. Иванов М.С. и др. Оптимизация ультразвуковой водной экстракции фенольных соединений из ягод облепихи (Hippophae rhamnoides L.) методом Бокса-Бенкена //Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. – 2026. – Т. 88, №. 1. – с. 176-183.
3. Корнаков И.А. и др. Оптимизация условий индукции синтеза проинсулина аспарт в клетках бактериального штамма-продуцента //БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. – 2023. – Т. 23, №. 2. – С. 219-230.
4. Лапа С.А. и др. Рекомбиназная полимеразная амплификация для быстрого выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека //Молекулярная биология. – 2023. – Т. 57, №. 3. – С. 539-45.
5. Тугашова Л.Г., Ситдикова И.П., Латипов Б.Н. Методы планирования эксперимента в задачах моделирования и управления на примере объектов топливно-энергетического комплекса //Вестник Дагестанского государственного технического университета. Технические науки. – 2025. – Т. 52, №. 4. – С. 154-164.
6. Хайруллин Р.Ф., Киямова Р.Г., Ризванов А.А. Экспрессия рекомбинантных белков в E. coli : учебное пособие. – Казань : Изд-во Казан. ун-та, 2018. – 143 c.
7. Хасаншина З.Р. и др. Разработка продуцентов терапевтических пептидов на основе Esherichia coli BL21 и технологии их культивирования //Разработка и регистрация лекарственных средств. – 2025. – Т. 14, №. 1. – С. 54-66.
8. Чемисова О.С. и др. Сравнительный анализ методов изотермической амплификации нуклеиновых кислот // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2022. – №. 1. – С. 126-138.
9. Almeida E.R.V. et al. A review of the use of central composite design in the optimization of procedures aiming at food chemical analysis //Food Chemistry. – 2025. Vol. 480. – P. 1-9.
10. Farzaneh F. et al. Response surface methodology to optimize the expression efficiency of recombinant reteplase //Iranian Journal of Biotechnology. – 2023. Vol. 21. №. 2. – P. 105-116.
11. Chew F.N. et al. Statistical optimization of green fluorescent protein production from Escherichia coli BL21 (DE3) //Preparative Biochemistry and Biotechnology. – 2012. Vol. 42. №. 6. – P. 535-550.
12. Koopaei N.N. et al. Optimization of rPDT fusion protein expression by Escherichia coli in pilot scale fermentation: a statistical experimental design approach //AMB Express. – 2018. Vol. 8. №. 1. – P. 135-144.
13. Kusuma S.A.F. et al. Optimization of culture conditions for Mpt64 synthetic gene expression in Escherichia coli BL21 (DE3) using surface response methodology //Heliyon. – 2019. Vol. 5. №. 11. – P. 1-9.
14. Szpisják-Gulyás N. et al. Methods for experimental design, central composite design and the Box–Behnken design, to optimise operational parameters: A review //Acta Alimentaria. – 2023. Vol. 52. №. 4. – P. 521-537.
15. Talluri V.P., Lanka S.S., Saladi V.R. Statistical optimization of process parameters by Central Composite Design (CCD) for an enhanced production of L-asparaginase by Myroides gitamensis BSH-3, a novel species //Avicenna journal of medical biotechnology. – 2019. Vol. 11. №. 1. – P. 59-66.